Autoradiografia. Radioautografia Metoda autoradiografii w cytologii
Autoradiografia autoradiografia, radioautografia, metoda badania rozmieszczenia substancji radioaktywnych w badanym obiekcie poprzez nałożenie na obiekt emulsji fotograficznej wrażliwej na promieniowanie radioaktywne. Substancje radioaktywne zawarte w obiekcie wydają się fotografować same siebie (stąd nazwa). Metoda A. jest szeroko stosowana w fizyce i technice, w biologii i medycynie - wszędzie tam, gdzie stosuje się znaczniki izotopowe. Po wywołaniu i utrwaleniu emulsji fotograficznej uzyskuje się na niej obraz przedstawiający badany rozkład. Istnieje kilka sposobów nakładania emulsji fotograficznej na przedmiot. Na wypolerowaną powierzchnię próbki można bezpośrednio nałożyć kliszę fotograficzną lub na próbkę można nałożyć ciepłą płynną emulsję, która po zestaleniu tworzy warstwę ściśle przylegającą do próbki i jest badana po naświetleniu i obróbce fotograficznej. Rozkład substancji radioaktywnych bada się porównując gęstość zaczernienia filmu z próbki testowej i referencyjnej (tzw. makroradiografia). Druga metoda polega na liczeniu śladów utworzonych przez cząsteczki jonizujące w emulsji fotograficznej za pomocą mikroskopu optycznego lub elektronowego (mikroradiografia). Ta metoda jest znacznie bardziej czuła niż pierwsza. Do otrzymywania makroautografów stosuje się emulsje transparentne i rentgenowskie, a do mikroautografów stosuje się specjalne emulsje drobnoziarniste. Fotograficzny obraz rozmieszczenia substancji promieniotwórczych w badanym obiekcie, uzyskany metodą A., nazywany jest autoradiogramem lub radioautografem. Na Ryż. 12
oraz 3
podano przykłady autoradiogramów. Metodą A. można wykryć obecność pierwiastków promieniotwórczych w różnych rudach, rozmieszczenie naturalnych pierwiastków promieniotwórczych w tkankach organizmów roślinnych i zwierzęcych itp. Wprowadzenie do organizmu związków znakowanych radioizotopami oraz dalsze badanie tkanek i komórek metodą A. umożliwia uzyskanie precyzyjnych danych o poszczególnych komórkach lub strukturach komórkowych, w których zachodzą określone procesy, zlokalizowane są określone substancje oraz ustalić parametry czasowe szeregu procesów. Na przykład zastosowanie radioaktywnego fosforu i A. umożliwiło wykrycie obecności intensywnego metabolizmu w rosnącej kości; zastosowanie jodu promieniotwórczego i A. umożliwiło wyjaśnienie wzorców czynności tarczycy; wprowadzenie związków znakowanych - prekursorów białek i kwasów nukleinowych oraz A. pomogło zrozumieć rolę pewnych struktur komórkowych w wymianie tych ważnych dla życia związków. Metoda A. pozwala określić nie tylko lokalizację radioizotopu w obiekcie biologicznym, ale także jego ilość, gdyż liczba zredukowanych ziaren srebra w emulsji jest proporcjonalna do liczby oddziałujących na nią cząstek. Ilościową analizę makroautografów przeprowadza się zwykłymi metodami fotometrycznymi (patrz Fotometria) ,
oraz mikroautografy - poprzez zliczanie pod mikroskopem ziarenek srebra lub śladów-śladów, które powstały w emulsji pod działaniem cząstek jonizujących. A. zaczynają z powodzeniem łączyć się z mikroskopią elektronową (patrz Mikroskopia elektronowa). Zobacz także Radiografia. Oświetlony.: Boyd DA Autoradiografia w biologii i medycynie, tłum. z angielskiego, M., 1957; Zhinkin L. N., Zastosowanie izotopów radioaktywnych w histologii, w książce: Radioznaczniki w histologii, L., 1959, s. 5-33; Perry R., Quantitative autoradiography, Methods in Cell Physiology, 1964, w. ja, rozdz. 15, str. 305-26. NG Chruszczow. Ryż. 2. Autoradiogram (odcisk) przedstawiający rozmieszczenie fosforu (32 P) w liściach pomidora. Roślinę umieszczono wcześniej w roztworze zawierającym radioaktywny fosfor. Jasne obszary odpowiadają podwyższonemu stężeniu izotopu promieniotwórczego; widać, że fosfor jest skoncentrowany na łodydze iw częściach naczyniowych liści. Ryż. 1. Mikroradiogram próbki niklu. Badana jest dyfuzja cyny znakowanej radioaktywnym izotopem 113 Sn w niklu. Rozkład radioaktywnej cyny pokazuje, że dyfuzja zachodzi głównie wzdłuż granic ziaren niklu.
Wielka radziecka encyklopedia. - M .: Sowiecka encyklopedia. 1969-1978 .
Synonimy:Zobacz, czym jest „Autoradiografia” w innych słownikach:
- (od auto... i radiografii) metoda rejestrowania rozmieszczenia substancji promieniotwórczych w obiekcie. Folia z emulsją wrażliwą na promieniowanie jest nakładana na powierzchnię (cięcie). Substancje radioaktywne niejako robią sobie zdjęcia ... ... Wielki słownik encyklopedyczny
- (radioautografia), metoda pomiaru rozmieszczenia promieniotwórczości. c c w badanym obiekcie (według własnego promieniowania), polegające na nałożeniu na niego warstwy jądrowej emulsji fotograficznej. Rozkład zależy od gęstości czernienia opracowanego ... ... Encyklopedia fizyczna
Metoda badania rozmieszczenia substancji promieniotwórczych (izotopów) w badanym obiekcie lub związkach. Polega na nałożeniu na przedmiot (lub np. chromatogram) emulsji fotograficznej wrażliwej na promieniowanie radioaktywne i uzyskanie odcisku, ... ... Słownik mikrobiologii
Istnieje., liczba synonimów: 4 autoradiografia (2) makroautoradiografia (1) ... Słownik synonimów
Autoradiografia. Zobacz radioautograf . (Źródło: „Angielsko-rosyjski słownik wyjaśniający terminów genetycznych”. Arefiev V.A., Lisovenko LA, Moskwa: VNIRO Publishing House, 1995) ... Biologia molekularna i genetyka. Słownik.
autoradiografia- Metoda badania rozmieszczenia promieniotwórczości. składników w badanej próbce przez własne promieniowanie poprzez nałożenie na próbkę wrażliwą na działanie promieniotwórcze. promieniowanie emulsyjne. Rozkład zależy od gęstości czernienia opracowanego ... ... Podręcznik tłumacza technicznego
Autoradiografia- * autoradiografia * autoradiografia patrz ... Genetyka. słownik encyklopedyczny
- (z auto... i radiografii), metoda rejestrowania rozmieszczenia substancji promieniotwórczych w obiekcie. Folia z emulsją wrażliwą na promieniowanie jest nakładana na powierzchnię (cięcie). Substancje radioaktywne niejako robią sobie zdjęcia ... ... słownik encyklopedyczny
Książki
- Autoradiography in Biology and Medicine, J. Boyd, Książka należy do jednego z twórców metody autoradiografii. Pierwsze osiem rozdziałów poświęcono teorii zagadnienia. Rozważają teorię procesu fotograficznego, właściwości i cechy ... Kategoria: Podstawy wiedzy medycznej Wydawca:
Autograf radiowy to stosunkowo nowa metoda, która ogromnie rozszerzyła możliwości zarówno mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej. Jest to metoda bardzo nowoczesna, ze względu na rozwój fizyki jądrowej, która umożliwiła otrzymywanie izotopów promieniotwórczych różnych pierwiastków. Do radioautografii, w szczególności, izotopy tych pierwiastków, które są wykorzystywane przez komórkę lub mogą wiązać się z substancjami wykorzystywanymi przez komórkę i które mogą być podawane zwierzętom lub dodawane do hodowli w ilościach, które nie zakłócają normalnego metabolizmu komórkowego. Ponieważ izotop promieniotwórczy (lub substancja nim oznaczona) uczestniczy w reakcjach biochemicznych w taki sam sposób jak jego nieradioaktywny odpowiednik, a jednocześnie emituje promieniowanie, drogę izotopów w organizmie można prześledzić za pomocą różnych metod wykrywania radioaktywność. Jednym ze sposobów wykrywania radioaktywności jest jej zdolność oddziaływania na kliszę fotograficzną jak światło; ale promieniowanie radioaktywne przenika przez czarny papier używany do ochrony filmu przed światłem i ma taki sam wpływ na film jak światło.
Aby móc wykryć promieniowanie emitowane przez izotopy promieniotwórcze na preparatach przeznaczonych do badań pod mikroskopem świetlnym lub elektronowym, preparaty pokrywa się w ciemnym pomieszczeniu specjalną emulsją fotograficzną, po czym pozostawia się je na jakiś czas w ciemności. Następnie slajdy są wywoływane (również w ciemności) i utrwalane. Obszary leku zawierające izotopy promieniotwórcze wpływają na leżącą nad nimi emulsję, w której pod wpływem emitowanego promieniowania pojawiają się ciemne „ziarna”. W ten sposób otrzymują autografy radiowe (z gr. radio- promienny samochody- ja i wykres- pisać).
Początkowo histolodzy mieli tylko kilka izotopów promieniotwórczych; na przykład wiele wczesnych badań z wykorzystaniem autoradiografii wykorzystywało radioaktywny fosfor. Znacznie więcej tych izotopów zostało później użytych; Radioaktywny izotop wodoru, tryt, znalazł szczególnie szerokie zastosowanie.
Autoradiografia była i nadal jest bardzo szeroko stosowana do badania, gdzie i jak zachodzą określone reakcje biochemiczne w organizmie.
Związki chemiczne znakowane izotopami promieniotwórczymi, które są wykorzystywane do badania procesów biologicznych, nazywane są prekursorami. Prekursory to zazwyczaj substancje podobne do tych, które organizm otrzymuje z pożywienia; służą jako elementy budulcowe do budowy tkanek i są włączane do złożonych składników komórek i tkanek w taki sam sposób, jak włączane są do nich nieoznaczone elementy budulcowe. Składnik tkankowy, do którego wprowadzony jest znakowany prekursor i który emituje promieniowanie, nazywany jest produktem.
Komórki wyhodowane w hodowli, chociaż tego samego typu, będą znajdować się w różnych stadiach cyklu komórkowego w dowolnym momencie, chyba że zostaną podjęte szczególne starania, aby zsynchronizować ich cykle. Jednak wstrzykując do komórek tryt-tymidynę, a następnie wykonując autografy, można określić czas trwania poszczególnych etapów cyklu. Czas wystąpienia jednego etapu - mitozy - można określić bez znakowanej tymidyny. W tym celu próbkę komórek z hodowli obserwuje się pod mikroskopem z kontrastem fazowym, co umożliwia bezpośrednie monitorowanie przebiegu mitozy i ustalenie jej czasu. Czas trwania mitozy wynosi zwykle 1 godzinę, chociaż w niektórych typach komórek trwa do 1,5 godziny.
Metoda autografu radiowego
Autograf radiowy, definicja, historia.
Metoda autoradiografii polega na wprowadzeniu do badanego obiektu związku „znakowanego” atomem promieniotwórczym i identyfikacji miejsca jego włączenia poprzez fotograficzną rejestrację promieniowania. Podstawą uzyskania obrazu jest oddziaływanie cząstek jonizujących powstających podczas rozpadu atomu promieniotwórczego na jądrową emulsję fotograficzną zawierającą kryształy halogenku srebra.
Odkrycie metody autoradiografii jest bezpośrednio związane z odkryciem zjawiska promieniotwórczości. W 1867 roku opublikowano pierwszą obserwację wpływu soli uranu na halogenki srebra (Niepce de St.Victor). W 1896 roku Henry Becquerel zaobserwował oświetlenie kliszy fotograficznej solami uranu bez uprzedniej ekspozycji na światło. Eksperyment ten uważany jest za moment odkrycia zjawiska promieniotwórczości. Autoradiografia zastosowana do materiału biologicznego została po raz pierwszy zastosowana przez Lacassagne i Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) w latach dwudziestych XX wieku; wycinek histologiczny z różnych narządów zwierząt po wprowadzeniu izotopów dociskano płaską stroną do kliszy rentgenowskiej i naświetlano. Wycinek histologiczny przygotowano wcześniej i poddano standardowej procedurze barwienia. Powstały autograf był badany oddzielnie od cięcia. Metoda ta umożliwia oszacowanie intensywności wbudowania izotopu w próbkę biologiczną. W latach czterdziestych XX wieku Leblond wykorzystał autoradiografię do wykazania rozmieszczenia izotopu jodu w skrawkach tarczycy (Leblond C.P. 1943).
Pierwsze próby połączenia autoradiografii z mikroskopią elektronową podjęto w latach pięćdziesiątych XX wieku (Liquir-Milward, 1956). Autoradiografia pod mikroskopem elektronowym jest szczególnym przypadkiem autoradiografii konwencjonalnej, w której zlicza się również ziarna srebra i uwzględnia ich rozmieszczenie. Osobliwością metody jest zastosowanie bardzo cienkiej warstwy emulsji. Obecnie uzyskano rozdzielczość około 50 nm, czyli 10-20 razy większą niż w przypadku mikroskopii świetlnej.
Obecnie metoda autoradiografii została uzupełniona o możliwość automatycznego szacowania liczby ziaren srebra za pomocą analizatorów wideo. Często do wzmocnienia sygnału znacznika (z reguły są to izotopy wysokoenergetyczne) stosuje się różnego rodzaju scyntylatory, osadzane na płytkach (ekran wzmacniający pokryty luminoforem) lub impregnowane do postaci emulsji (PPO) – w tym przypadku , emisja fotonów oświetla konwencjonalną kliszę fotograficzną lub kliszę.
Fotograficzna zasada uzyskiwania obrazu, emulsja fotograficzna
W badaniu radiograficznym rolę detektora rozpadu jądrowego pełni emulsja fotograficzna, w której po przejściu cząstki jonizującej pozostaje obraz utajony, który następnie ujawnia się podczas wywoływania, podobnie jak w przypadku obróbki zwykłej kliszy fotograficznej.
Fotoemulsja to zawiesina mikrokryształów halogenku srebra w żelatynie. Mikrokryształy mają defekty strukturalne zwane centrami wrażliwości. Zgodnie z modelem Gurneya-Motta zaburzenia te w sieci jonowej kryształu są w stanie wychwycić elektrony uwalniane, gdy cząstka alfa lub beta przechodzi przez pasmo przewodnictwa kryształu, w wyniku czego jon przekształca się w atom . Powstały obraz utajony można ujawnić za pomocą procedury, która przekształca aktywowane kryształy halogenku srebra w ziarna metalicznego srebra (proces ten nazywa się rozwojem chemicznym). Jako wywoływacz można zastosować dowolny środek o wystarczającej aktywności redukującej (zwykle w fotografii i autoradiografii stosuje się metol, amidol lub hydrochinon). Po naświetleniu naświetlonych kryształów pozostałe mikrokryształy halogenku srebra są usuwane z emulsji za pomocą utrwalacza (zwykle podsiarczynu). Jądrowe emulsje fotograficzne charakteryzują się rozdzielczością (ziarnistość) i czułością. Pierwsza jest określona przez wielkość mikrokryształów soli srebra i jest odwrotnie proporcjonalna do drugiej. Emulsja fotograficzna charakteryzuje się zmniejszoną wrażliwością na światło widzialne, jednak praca z nią musi być wykonywana w ciemności, aby wykluczyć pojawienie się artefaktów.
Emulsję można nakładać na lek w postaci gotowej błony z podłożem lub poprzez zanurzenie leku w podgrzanej płynnej emulsji - w ten sposób uzyskuje się cienką jednolitą warstwę, którą rozwija się w zwykły sposób. Przed nałożeniem emulsji do mikroskopii świetlnej szkiełko zwykle barwi się pożądanym barwnikiem histologicznym, ale jaśniejszym niż zwykle, aby umożliwić policzenie ziaren srebra we wszystkich obszarach. Lek jest narażony na określony czas, a następnie jest rozwijany.
Izotopy stosowane w autoradiografii.
W autoradiografii, w zależności od celów badań i dostępnych materiałów, można stosować różne izotopy. Obraz tworzony przez cząstkę jonizującą na jądrowej emulsji fotograficznej zależy od energii cząstki i rodzaju jej oddziaływania z materią.
Cząstki alfa emitowane przez identyczne jądra promieniotwórcze mają taką samą energię ( mi) i tej samej długości ścieżki ( R) , połączone następującą relacją:
R = kE3/2
Gdzie k – stała charakteryzująca ośrodek, w którym propagują się cząstki. Zakres cząstek w sercu zależy od jego gęstości i składu pierwiastkowego. Relacja Bragga-Klymena pozwala oszacować zasięg w substancji o masie atomowej A i gęstości przez zasięg cząstek alfa w powietrzu (R0) d:
R= 0,0003 (R0 / d) A1/2
Ponieważ moc jonizująca cząstek alfa jest bardzo duża, ułatwia to fotograficzną rejestrację rozkładu izotopów, a także pozwala na wykorzystanie do rejestracji materiałów nieemulsyjnych. Ślad cząstek alfa emitowanych z jednego źródła, na autografach, wygląda jak wiązka prostych segmentów, zwykle o długości 15-50 mikronów, wychodzących z jednego punktu, co pozwala dokładnie zlokalizować miejsce włączenia znacznika radioaktywnego. Jednak cząstki alfa są emitowane przez izotopy o dużej liczbie atomowej, co ogranicza ich wykorzystanie jako znacznika biologicznego.
Ślady cząstek alfa są często obserwowane na radiogramach histologicznych jako artefakt - wynik samopromieniowania izotopów w szkiełku podstawowym.
Promieniowanie Beta charakteryzuje się ciągłym widmem energii początkowej cząstek - od zera do Emax wyznaczonej dla każdego izotopu. Kształty widma różnią się znacznie. Zatem najbardziej prawdopodobna energia cząstek emitowanych przez trytem wynosi 1/7 E max, 14C - około ¼, 32P - około 1/3. Maksymalna energia promieniowania beta różnych izotopów waha się od 18 keV do 3,5 MeV - w znacznie szerszym zakresie niż promieniowanie alfa. Z reguły maksymalna energia jest wyższa dla izotopów krótkotrwałych.
Przechodzeniu cząstek beta i monoenergetycznych elektronów przez materię towarzyszą dwa główne rodzaje oddziaływań. Oddziałując z orbitującym elektronem, cząstka może przekazać mu energię wystarczającą do zjonizowania atomu (usunięcia elektronu z orbity). W rzadkich przypadkach energia ta jest tak duża, że można zaobserwować tor uwolnionego elektronu. Ze względu na równość mas cząstki i elektronu następuje odchylenie od ruchu początkowego. Oddziaływanie drugiego typu, z jądrami atomowymi, prowadzi do pojawienia się promieni rentgenowskich bremsstrahlung. Chociaż ta ostatnia nie jest rejestrowana przez emulsję, akt oddziaływania cząstki z jądrem można wykryć po ostrym załamaniu trajektorii.
Wielokrotne oddziaływanie z orbitującymi elektronami prowadzi do zakrzywienia trajektorii, która zwykle wygląda jak kręta linia, zwłaszcza w końcowej części, kiedy prędkość cząstki maleje, a moc jonizacji wzrasta. Długość trajektorii zauważalnie przekracza odległość od punktu początkowego do końcowego toru - biegu. Z tego powodu nawet elektrony monoenergetyczne charakteryzują się obecnością zakresu zakresów ograniczonego od góry Rmax, co jest typowe dla tego promieniowania. Ze względu na mniejsze straty jonizacji cząstki beta są trudniejsze do wykrycia niż cząstki alfa. Nie tworzą one ciągłych ścieżek (z wyjątkiem najdelikatniejszego promieniowania trytu – jednak w tym przypadku prawdopodobieństwo przejścia przez więcej niż jeden kryształ emulsji jest niewielkie), gęstość i liczba rozwiniętych kryształów waha się w różnych granicach. Zasięg cząstki beta w innym elemencie można oszacować ze wzoru:
R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)
W szerokim zakresie wartości E maks maksymalny przebieg jest powiązany z maksymalną energią zależnością:
R m= 412 E maks 1,265 – 0,0954 lnE maks
Różnicę w zasięgu, zdolności jonizacyjnej i gęstości powstałych kryształów emulsji dla cząstek o różnych energiach można wykorzystać do rozróżnienia rozkładu pierwiastków, jeśli ich izotopy znacznie różnią się w Emax, jak w przypadku trytu i 14C. Dyskryminacja rozkładu dwóch izotopów odbywa się poprzez nałożenie na próbkę dwóch warstw emulsji, pierwsza warstwa rejestruje głównie promieniowanie miękkie, druga – twarde. Według niektórych prac różne izotopy można wiarygodnie rozdzielić na podstawie wielkości kryształów powstałej emulsji - kryształy, na które oddziałuje cząstka beta trytu, która ma większą moc jonizacji, są większe.
Elektrony konwersji wewnętrznej powstają, gdy kwant gamma o bardzo niskiej energii promieniowania jest absorbowany i elektron jest usuwany z wewnętrznej powłoki atomu. Te elektrony są podobne do miękkich cząstek beta, ale w przeciwieństwie do tych ostatnich są monoenergetyczne. Obecność elektronów konwersji wewnętrznej umożliwia stosowanie izotopów, takich jak 125I.
Obecnie najczęściej stosowanymi izotopami emitującymi cząstki beta. Z reguły tryt jest używany do znakowania w badaniach histologicznych. Pierwsze autografy z użyciem trytu wykonano już w latach pięćdziesiątych XX wieku (Fitzgerald i in. 1951), ale jego szerokie zastosowanie rozpoczęło się po uzyskaniu tymidyny znakowanej trytem w Brookhaven Laboratory. Ponieważ wodór jest częścią wszystkich substancji organicznych, przy użyciu trytu można uzyskać różnorodne związki, które mają radioaktywną etykietę. Im mniejsza energia emitowanej cząstki, tym krótszy jest jej ślad podczas poruszania się w emulsji fotograficznej i tym dokładniej można zlokalizować położenie oznakowanego atomu. Długość drogi cząstek trytu beta wynosi około 1-2 μm, najbardziej prawdopodobna energia to 0,005 MeV, a ścieżka składa się w większości przypadków z pojedynczego ziarna srebra, co umożliwia zlokalizowanie źródła promieniowania nie tylko w stosunkowo dużych komórkach struktur, takich jak jądro, ale także w poszczególnych chromosomach.
Wprowadzenie do organizmu „znakowanych” metabolitów umożliwia prześledzenie wbudowywania się izotopu do komórek tkanek zwierzęcych, co umożliwia badanie różnorodnych procesów biochemicznych w żywym organizmie.
Uzyskanie danych bezwzględnych – stężenie substancji znakowanej w badanym obiekcie rzadko jest celem badań radioautograficznych, do tego konieczna jest znajomość szeregu warunków, których określenie jest trudne. Dlatego ilościowe badania radioautograficzne są zwykle przeprowadzane przez porównanie stężenia ziaren srebra nad obiektem testowym i kontrolą, podczas gdy dane kontrolne są dogodnie przyjmowane jako jeden lub 100%.
Charakterystyka niektórych stosowanych izotopów
w radioautografii obiektów biologicznych
Metoda autografu radiowego
Autograf radiowy, definicja, historia.
Metoda autoradiografii polega na wprowadzeniu do badanego obiektu związku „znakowanego” atomem promieniotwórczym i identyfikacji miejsca jego włączenia poprzez fotograficzną rejestrację promieniowania. Podstawą uzyskania obrazu jest oddziaływanie cząstek jonizujących powstających podczas rozpadu atomu promieniotwórczego na jądrową emulsję fotograficzną zawierającą kryształy halogenku srebra.
Odkrycie metody autoradiografii jest bezpośrednio związane z odkryciem zjawiska promieniotwórczości. W 1867 roku opublikowano pierwszą obserwację wpływu soli uranu na halogenki srebra (Niepce de St.Victor). W 1896 roku Henry Becquerel zaobserwował oświetlenie kliszy fotograficznej solami uranu bez uprzedniej ekspozycji na światło. Eksperyment ten uważany jest za moment odkrycia zjawiska promieniotwórczości. Autoradiografia zastosowana do materiału biologicznego została po raz pierwszy zastosowana przez Lacassagne i Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) w latach dwudziestych XX wieku; wycinek histologiczny z różnych narządów zwierząt po wprowadzeniu izotopów dociskano płaską stroną do kliszy rentgenowskiej i naświetlano. Wycinek histologiczny przygotowano wcześniej i poddano standardowej procedurze barwienia. Powstały autograf był badany oddzielnie od cięcia. Metoda ta umożliwia oszacowanie intensywności wbudowania izotopu w próbkę biologiczną. W latach czterdziestych XX wieku Leblond wykorzystał autoradiografię do wykazania rozmieszczenia izotopu jodu w skrawkach tarczycy (Leblond C.P. 1943).
Pierwsze próby połączenia autoradiografii z mikroskopią elektronową podjęto w latach pięćdziesiątych XX wieku (Liquir-Milward, 1956). Autoradiografia pod mikroskopem elektronowym jest szczególnym przypadkiem autoradiografii konwencjonalnej, w której zlicza się również ziarna srebra i uwzględnia ich rozmieszczenie. Osobliwością metody jest zastosowanie bardzo cienkiej warstwy emulsji. Obecnie uzyskano rozdzielczość około 50 nm, czyli 10-20 razy większą niż w przypadku mikroskopii świetlnej.
Obecnie metoda autoradiografii została uzupełniona o możliwość automatycznego szacowania liczby ziaren srebra za pomocą analizatorów wideo. Często do wzmocnienia sygnału znacznika (z reguły są to izotopy wysokoenergetyczne) stosuje się różnego rodzaju scyntylatory, osadzane na płytkach (ekran wzmacniający pokryty luminoforem) lub impregnowane do postaci emulsji (PPO) – w tym przypadku , emisja fotonów oświetla konwencjonalną kliszę fotograficzną lub kliszę.
Fotograficzna zasada uzyskiwania obrazu, emulsja fotograficzna
W badaniu radiograficznym rolę detektora rozpadu jądrowego pełni emulsja fotograficzna, w której po przejściu cząstki jonizującej pozostaje obraz utajony, który następnie ujawnia się podczas wywoływania, podobnie jak w przypadku obróbki zwykłej kliszy fotograficznej.
Fotoemulsja to zawiesina mikrokryształów halogenku srebra w żelatynie. Mikrokryształy mają defekty strukturalne zwane centrami wrażliwości. Zgodnie z modelem Gurneya-Motta zaburzenia te w sieci jonowej kryształu są w stanie wychwycić elektrony uwalniane, gdy cząstka alfa lub beta przechodzi przez pasmo przewodnictwa kryształu, w wyniku czego jon przekształca się w atom . Powstały obraz utajony można ujawnić za pomocą procedury, która przekształca aktywowane kryształy halogenku srebra w ziarna metalicznego srebra (proces ten nazywa się rozwojem chemicznym). Jako wywoływacz można zastosować dowolny środek o wystarczającej aktywności redukującej (zwykle w fotografii i autoradiografii stosuje się metol, amidol lub hydrochinon). Po naświetleniu naświetlonych kryształów pozostałe mikrokryształy halogenku srebra są usuwane z emulsji za pomocą utrwalacza (zwykle podsiarczynu). Jądrowe emulsje fotograficzne charakteryzują się rozdzielczością (ziarnistość) i czułością. Pierwsza jest określona przez wielkość mikrokryształów soli srebra i jest odwrotnie proporcjonalna do drugiej. Emulsja fotograficzna charakteryzuje się zmniejszoną wrażliwością na światło widzialne, jednak praca z nią musi być wykonywana w ciemności, aby wykluczyć pojawienie się artefaktów.
Emulsję można nakładać na lek w postaci gotowej błony z podłożem lub poprzez zanurzenie leku w podgrzanej płynnej emulsji - w ten sposób uzyskuje się cienką jednolitą warstwę, którą rozwija się w zwykły sposób. Przed nałożeniem emulsji do mikroskopii świetlnej szkiełko zwykle barwi się pożądanym barwnikiem histologicznym, ale jaśniejszym niż zwykle, aby umożliwić policzenie ziaren srebra we wszystkich obszarach. Lek jest narażony na określony czas, a następnie jest rozwijany.
Izotopy stosowane w autoradiografii.
W autoradiografii, w zależności od celów badań i dostępnych materiałów, można stosować różne izotopy. Obraz tworzony przez cząstkę jonizującą na jądrowej emulsji fotograficznej zależy od energii cząstki i rodzaju jej oddziaływania z materią.
Cząstki alfa emitowane przez identyczne jądra promieniotwórcze mają taką samą energię ( mi) i tej samej długości ścieżki ( R) , połączone następującą relacją:
R = kE 3/2
Gdzie k – stała charakteryzująca ośrodek, w którym propagują się cząstki. Zakres cząstek w sercu zależy od jego gęstości i składu pierwiastkowego. Relacja Bragga-Klymena umożliwia oszacowanie zasięgu cząstek alfa w powietrzu (R 0) w substancji o masie atomowej A i gęstości d:
R= 0,0003 (R0 / d) A 1/2
Ponieważ moc jonizująca cząstek alfa jest bardzo duża, ułatwia to fotograficzną rejestrację rozkładu izotopów, a także pozwala na wykorzystanie do rejestracji materiałów nieemulsyjnych. Ślad cząstek alfa emitowanych z jednego źródła, na autografach, wygląda jak wiązka prostych segmentów, zwykle o długości 15-50 mikronów, wychodzących z jednego punktu, co pozwala dokładnie zlokalizować miejsce włączenia znacznika radioaktywnego. Jednak cząstki alfa są emitowane przez izotopy o dużej liczbie atomowej, co ogranicza ich wykorzystanie jako znacznika biologicznego.
Ślady cząstek alfa są często obserwowane na radiogramach histologicznych jako artefakt - wynik samopromieniowania izotopów w szkiełku podstawowym.
Przechodzeniu cząstek beta i monoenergetycznych elektronów przez materię towarzyszą dwa główne rodzaje oddziaływań. Oddziałując z orbitującym elektronem, cząstka może przekazać mu energię wystarczającą do zjonizowania atomu (usunięcia elektronu z orbity). W rzadkich przypadkach energia ta jest tak duża, że można zaobserwować tor uwolnionego elektronu. Ze względu na równość mas cząstki i elektronu następuje odchylenie od ruchu początkowego. Oddziaływanie drugiego typu, z jądrami atomowymi, prowadzi do pojawienia się promieni rentgenowskich bremsstrahlung. Chociaż ta ostatnia nie jest rejestrowana przez emulsję, akt oddziaływania cząstki z jądrem można wykryć po ostrym załamaniu trajektorii.
Wielokrotne oddziaływanie z orbitującymi elektronami prowadzi do zakrzywienia trajektorii, która zwykle wygląda jak kręta linia, zwłaszcza w końcowej części, kiedy prędkość cząstki maleje, a moc jonizacji wzrasta. Długość trajektorii zauważalnie przekracza odległość od punktu początkowego do końcowego toru - biegu. Z tego powodu nawet elektrony monoenergetyczne charakteryzują się obecnością zakresu zakresów ograniczonego od góry Rmax, co jest typowe dla tego promieniowania. Ze względu na mniejsze straty jonizacji cząstki beta są trudniejsze do wykrycia niż cząstki alfa. Nie tworzą one ciągłych ścieżek (z wyjątkiem najdelikatniejszego promieniowania trytu – jednak w tym przypadku prawdopodobieństwo przejścia przez więcej niż jeden kryształ emulsji jest niewielkie), gęstość i liczba rozwiniętych kryształów waha się w różnych granicach. Zasięg cząstki beta w innym elemencie można oszacować ze wzoru:
R = R A1 (Z/A) A1 / (Z/A)
W szerokim zakresie wartości E maks maksymalny przebieg jest powiązany z maksymalną energią zależnością:
R m= 412 E maks 1,265 – 0,0954 lnE maks
Różnicę w zasięgach, zdolności jonizacyjnej i gęstości powstałych kryształów emulsji dla cząstek o różnych energiach można wykorzystać do rozróżnienia rozkładu pierwiastków, jeśli ich izotopy znacznie różnią się w Emax, jak w przypadku trytu i 14 C. Dyskryminacja rozkład dwóch izotopów odbywa się poprzez nałożenie na próbkę dwóch warstw emulsji, pierwsza warstwa rejestruje głównie promieniowanie miękkie, druga – twarde. Według niektórych prac różne izotopy można wiarygodnie rozdzielić na podstawie wielkości kryształów powstałej emulsji - kryształy, na które oddziałuje cząstka beta trytu, która ma większą moc jonizacji, są większe.
Elektrony konwersji wewnętrznej powstają, gdy kwant gamma o bardzo niskiej energii promieniowania jest absorbowany i elektron jest usuwany z wewnętrznej powłoki atomu. Te elektrony są podobne do miękkich cząstek beta, ale w przeciwieństwie do tych ostatnich są monoenergetyczne. Obecność elektronów konwersji wewnętrznej pozwala na zastosowanie izotopów takich jak 125I.
Obecnie najczęściej stosowanymi izotopami emitującymi cząstki beta. Z reguły tryt jest używany do znakowania w badaniach histologicznych. Pierwsze autografy z użyciem trytu wykonano już w latach pięćdziesiątych XX wieku (Fitzgerald i in. 1951), ale jego szerokie zastosowanie rozpoczęło się po uzyskaniu tymidyny znakowanej trytem w Brookhaven Laboratory. Ponieważ wodór jest częścią wszystkich substancji organicznych, przy użyciu trytu można uzyskać różnorodne związki, które mają radioaktywną etykietę. Im mniejsza energia emitowanej cząstki, tym krótszy jest jej ślad podczas poruszania się w emulsji fotograficznej i tym dokładniej można zlokalizować położenie oznakowanego atomu. Długość drogi cząstek trytu beta wynosi około 1-2 μm, najbardziej prawdopodobna energia to 0,005 MeV, a ścieżka składa się w większości przypadków z pojedynczego ziarna srebra, co umożliwia zlokalizowanie źródła promieniowania nie tylko w stosunkowo dużych komórkach struktur, takich jak jądro, ale także w poszczególnych chromosomach.
Wprowadzenie do organizmu „znakowanych” metabolitów umożliwia prześledzenie wbudowywania się izotopu do komórek tkanek zwierzęcych, co umożliwia badanie różnorodnych procesów biochemicznych w żywym organizmie.
Uzyskanie danych bezwzględnych – stężenie substancji znakowanej w badanym obiekcie rzadko jest celem badań radioautograficznych, do tego konieczna jest znajomość szeregu warunków, których określenie jest trudne. Dlatego ilościowe badania radioautograficzne są zwykle przeprowadzane przez porównanie stężenia ziaren srebra nad obiektem testowym i kontrolą, podczas gdy dane kontrolne są dogodnie przyjmowane jako jeden lub 100%.
Charakterystyka niektórych stosowanych izotopów
w radioautografii obiektów biologicznych
Cząsteczki beta radioaktywnego fosforu są w stanie polecieć na odległość do kilku milimetrów w emulsji jądrowej, tor składa się z kilkudziesięciu rzadko zlokalizowanych cząsteczek srebra - np. , nie można ustalić lokalizacji w poszczególnych strukturach komórkowych.
Radioaktywną siarkę i węgiel można wykorzystać do zlokalizowania izotopu w poszczególnych komórkach, pod warunkiem, że są one duże lub odpowiednio oddalone od siebie, co można osiągnąć w rozmazach krwi lub zawiesinach komórkowych.
Błędy rozdzielczości i metody, błędy metody.
błąd geometryczny– dzięki temu, że emitowaną cząstkę można skierować pod dowolnym kątem do powierzchni fotowarstwy. W konsekwencji ziarno srebra w fotowarstwie może nie znajdować się dokładnie nad atomem radioaktywnym, ale mniej lub bardziej przesunięte w zależności od kierunku ruchu cząstki i długości drogi (energii).
błąd fotograficzny wynika z faktu, że ziarno srebra, składające się z tysięcy atomów metalu, jest znacznie większe niż atom promieniotwórczy. Dlatego lokalizację mniejszego obiektu należy oceniać na podstawie położenia większego.
Przy zastosowaniu trytu, który charakteryzuje się niską energią (przebiegiem) emitowanych cząstek oraz jądrowych emulsji fotograficznych o małej granulacji, rozdzielczość metody autoradiografii mieści się w granicach rozdzielczości układów optycznych - 1 μm. Błędy te nie mają więc istotnego wpływu na wynik.
Aby uzyskać lepszą rozdzielczość, konieczne jest zmniejszenie grubości cięcia, warstwy emulsji i odległości między nimi. Próbka powinna być lekko niedoświetlona.
Efekt automatycznej absorpcji: Liczba ziaren srebra zależy od stopnia absorpcji promieniowania przez struktury komórkowe, ze względu na mały zasięg i niską energię cząstek beta ich absorpcja w tkankach jest dość duża, co może prowadzić do utraty znaku, więc kwestia grubość sekcji staje się ważna. Wykazano, że liczba ziaren srebra jest proporcjonalna do radioaktywności tkanki tylko przy grubości warstwy nie większej niż 5 mikronów.
Względna liczba cząstek beta, które przeszły przez warstwę absorbera o określonej grubości X można oszacować zgodnie z prawem Baera -
N x/N 0 = e - m x
gdzie m jest współczynnikiem absorpcji (odwrotnością grubości warstwy, podczas której przejścia liczba cząstek maleje w mi raz. Wartość współczynnika absorpcji można w przybliżeniu oszacować na podstawie wartości R m(maksymalny zasięg), znany dla wszystkich izotopów, przy użyciu zależności m R m= 10, co jest ważne dla niezbyt mocnego promieniowania.
Jeżeli w warstwie o jednostkowej grubości w jednostce czasu w kierunku powierzchni porusza się n cząstek, to w próbce o grubości X powierzchnia osiągnie N cząstek:
Tło i artefakty: Do błędu w pomiarach wprowadzają również wpływy mechaniczne – zarysowania, pęknięcia emulsji prowadzące do powstania obrazu utajonego oraz promieniowania tła, co należy uwzględnić przy obróbce autografów. Tło jest brane pod uwagę, zliczając liczbę ziaren srebra w pustym obszarze preparatu. Błędy wprowadzane są również w wyniku obróbki histologicznej skrawków - okablowanie pod kątem alkoholi (odwodnienie), zatapianie w parafinie, barwienie. Procedury te mogą wpływać na wielkość i stosunek struktur komórkowych.
Efekt promieniowania znakowanych metabolitów: Ze względu na niską energię promieniowania tryt powoduje znaczną jonizację w ogniwie, znacznie większą niż efekt radiacyjny cząstek beta węgla. W efekcie przy przedłużonym działaniu związku znakowanego, np. 3H-tymidyny, komórki ulegają zniszczeniu i obumierają, co prowadzi do zahamowania wzrostu tkanki. Przede wszystkim zaburzona jest spermatogeneza. Istnieją dowody na działanie mutagenne i rakotwórcze znakowanych metabolitów. Obserwowane zmiany cytologiczne polegają na zaburzeniu przejścia cyklu mitotycznego przez komórki, zmianie ploidalności komórek oraz pojawieniu się aberracji chromosomowych. Ale najwyraźniej szkodliwy wpływ izotopu na komórki może zauważalnie wpłynąć na wyniki badania tylko w warunkach długiego eksperymentu.
Kwantyfikacja radioaktywności
Z reguły w eksperymencie określa się nie bezwzględną, ale względną ilość zawartego izotopu. Stopień inkluzji nalepki można ocenić dwojako – densytometrycznie – co bardziej odpowiada makroautografom i bezpośredniemu liczeniu ziarenek srebra nad przedmiotami. Ta czasochłonna procedura może być obecnie wykonana przy użyciu komputera. Cyfrowy obraz preparatu histologicznego jest przetwarzany przez specjalne oprogramowanie w celu automatycznego podświetlenia na nim komórek i struktur komórkowych oraz zliczenia ilości ziaren srebra. Jeśli pojawia się kwestia oceny ilościowej, konieczne jest uwzględnienie pojęcia efektywności. Najczęściej wydajność rozumiana jest jako liczba ziaren srebra powstałych podczas rejestracji jednego rozpadu promieniotwórczego. Na skuteczność metody wpływa wiele czynników, przede wszystkim grubość przedmiotu oraz emulsja.
W badaniach z użyciem licznika scyntylacyjnego stwierdzono wysoką korelację między średnią liczbą rozpadów na minutę a liczbą ziaren srebra. Według Hunta (Hunt i Foote, 1967) powstanie jednego ziarna w emulsji użytej w eksperymencie odpowiada 5,8 rozpadom promieniotwórczym, czyli skuteczność metody wynosi 17,8%.
Do ilościowego oznaczenia trytu w preparatach makroskopowych można użyć próbek o standardowej aktywności, które są umieszczone na tym samym autografie.
Dokładna ocena radioaktywności porównywanych obiektów biologicznych jest bardzo trudna.
Klasycznym przykładem badania radioautograficznego jest praca nad akumulacją 32P w DNA komórek korzeni bobiku (Howard i Pelc, 1953). W tym eksperymencie podział cyklu mitotycznego na cztery okresy (mitoza - M, G 1 - okres presyntetyczny, S - synteza DNA, okres pretotyczny G 2) wykazał po raz pierwszy, że okres syntezy DNA zajmuje ograniczony część interfazy, oddzielona w czasie od początku i końca mitozy. Dane Howarda i Pelka znalazły później potwierdzenie w bardziej precyzyjnych eksperymentach z użyciem specyficznego prekursora DNA, 3H-tymidyny.
Metody oceny syntezy białek. Najczęstszymi prekursorami do oceny syntezy białek całkowitych w badaniach radioautograficznych są 3H-leucyna, 3H-metionina, 3H-fenyloalanina. Na przykład, syntezę białka całkowitego w mózgu szczurów podczas pierwszych tygodni rozwoju postnatalnego badano stosując znacznik leucynowy (Pavlik i Jakoubek, 1976). Do badania syntezy histonów i ich wpływu na regulację transkrypcji wykorzystuje się podstawowe aminokwasy 3H-lizynę i 3H-argininę, a 3H-tryptofan do badania syntezy kwaśnych białek. Gęstość inkluzji znacznika aminokwasowego odpowiada intensywności syntezy białek, a zatem odzwierciedla aktywność funkcjonalną neuronu. Metoda radioautograficzna umożliwia porównanie charakterystyki syntezy białek w różnych tkankach zwierzęcych poddanych eksperymentalnej ekspozycji oraz pozwala prześledzić dynamikę zmian na poziomie poszczególnych typów komórek i struktur komórkowych (jądro, ciało komórki, procesy neuronalne – aksonalne transport).
Obecnie autoradiografia jest często wykorzystywana do badania mózgu w badaniach z użyciem radioligandów dla określonych receptorów. W ten sposób skonstruowano mapy rozmieszczenia różnych receptorów w strukturach mózgowych zwierząt i ludzi.
Autoradiografia jest również wykorzystywana do wizualizacji żeli w biochemii oraz w połączeniu z testami immunologicznymi (RIA).
Bibliografia:
1. Epifanova O.I. i wsp. Autograf radiowy M., Szkoła Wyższa, 1977
2. Sarkisov D.S. Perow Yu.L. Technika mikroskopowa M.: „Medycyna”, 1996
3.Rogers A.W. Praktyczna autoradiografia, Amersham UK, 1982
4.Boksztejn S.Z. Ginzburg SS i wsp. Autoradiografia mikroskopowa elektronów w metaloznawstwie M., „Metallurgy”
Autoradiogram a fija, autoradiografia, autoradiografia , metoda badania rozmieszczenia substancji radioaktywnych w badanym obiekcie poprzez nałożenie na obiekt emulsji fotograficznej wrażliwej na promieniowanie radioaktywne. Substancje promieniotwórcze zawarte w obiekcie robienia sobie zdjęć(stąd nazwa). Metoda autoradiografii jest szeroko stosowana w fizyce i technice, w biologii i medycynie, wszędzie tam, gdzie stosuje się znaczniki izotopowe.
Po wywołaniu i utrwaleniu emulsji fotograficznej uzyskuje się na niej obraz przedstawiający badany rozkład. Istnieje kilka sposobów nakładania emulsji fotograficznej na przedmiot. Na wypolerowaną powierzchnię próbki można bezpośrednio nałożyć kliszę fotograficzną lub na próbkę można nałożyć ciepłą płynną emulsję, która po zestaleniu tworzy warstwę ściśle przylegającą do próbki i jest badana po naświetleniu i obróbce fotograficznej. Rozmieszczenie substancji radioaktywnych bada się przez porównanie gęstość zaczernienia filmu z próbki testowej i wzorcowej(tzw. makroradiografia).
Druga metoda polega na liczeniu śladów utworzonych przez cząstki jonizujące w emulsji fotograficznej za pomocą optyczny lub mikroskop elektronowy (mikroradiografia). Ta metoda jest znacznie bardziej czuła niż pierwsza. Do otrzymywania makroautografów stosuje się emulsje transparentne i rentgenowskie, a do mikroautografów stosuje się specjalne emulsje drobnoziarniste.
Nazywa się fotograficzny obraz rozmieszczenia substancji promieniotwórczych w badanym obiekcie, uzyskany za pomocą autoradiografii autoradiogram lub radioautograf.
Wprowadzenie do organizmu związków znakowanych radioizotopami oraz dalsze badanie tkanek i komórek metodą autoradiografii pozwala na:
- uzyskać dokładne informacje nt które komórki lub struktur komórkowych zachodzą określone procesy,
- zlokalizowane substancje,
- ustawić parametry czasowe dla wielu procesów.
Na przykład zastosowanie radioaktywnego fosforu i autoradiografii pozwoliło wykryć obecność intensywnego metabolizmu w rosnącej kości; zastosowanie jodu promieniotwórczego i autoradiografii umożliwiło wyjaśnienie wzorców czynności tarczycy; wprowadzenie związków znakowanych - prekursorów białek i kwasów nukleinowych oraz autoradiografia pozwoliły wyjaśnić rolę pewnych struktur komórkowych w wymianie tych ważnych dla życia związków. Metoda autoradiografii pozwala określić nie tylko lokalizację radioizotopu w obiekcie biologicznym, ale także jego ilość, ponieważ liczba zredukowanych ziaren srebra w emulsji jest proporcjonalna do liczby oddziałujących na nią cząstek. Analiza ilościowa makroautografy wykonuje się zwykłymi metodami fotometrycznymi, a mikroautografy - przez zliczanie pod mikroskopem ziarenek srebra lub śladów-śladów, które powstały w emulsji pod działaniem cząstek jonizujących. Autoradiografię zaczyna się z powodzeniem łączyć z mikroskopią elektronową
