Autoradiografie. Radioautografia Metoda autoradiografiei în citologie
Autoradiografie autoradiografie, radioautografie, metodă de studiere a distribuției substanțelor radioactive într-un obiect studiat prin impunerea unei emulsii fotografice sensibile la radiațiile radioactive asupra obiectului. Substanțele radioactive conținute în obiect par să se fotografieze singure (de unde și numele). Metoda A. este utilizată pe scară largă în fizică și tehnologie, în biologie și medicină - peste tot unde se folosesc trasori izotopi. Dupa dezvoltarea si fixarea emulsiei fotografice se obtine pe aceasta o imagine care afiseaza distributia studiata. Există mai multe moduri de a aplica emulsie fotografică pe un obiect. O placă fotografică poate fi aplicată direct pe suprafața lustruită a probei sau o emulsie lichidă caldă poate fi aplicată pe eșantion, care, atunci când se solidifică, formează un strat strâns adiacent probei și este examinată după expunere și prelucrare foto. Distribuția substanțelor radioactive este studiată prin compararea densității de înnegrire a filmului din proba de testare și de referință (așa-numita macroradiografie). A doua metodă constă în numărarea urmelor formate din particule ionizante într-o emulsie fotografică cu ajutorul unui microscop optic sau electronic (microradiografie). Această metodă este mult mai sensibilă decât prima. Pentru obținerea de macroautografe se folosesc emulsii de transparență și raze X, iar emulsii speciale cu granulație fină sunt folosite pentru microautografe. O imagine fotografică a distribuției substanțelor radioactive în obiectul studiat, obținută prin metoda A., se numește autoradiogramă sau radioautograf. Pe orez. 12
și 3
sunt date exemple de autoradiograme. Metoda A. poate detecta prezența elementelor radioactive în diverse minereuri, distribuția elementelor radioactive naturale în țesuturile organismelor vegetale și animale și așa mai departe. Introducerea compușilor marcați cu radioizotopi în organism și examinarea ulterioară a țesuturilor și celulelor prin metoda lui A. face posibilă obținerea de date precise despre anumite celule sau structuri celulare în care au loc anumite procese, anumite substanțe sunt localizate și să stabilirea parametrilor de timp ai unui număr de procese. Deci, de exemplu, utilizarea fosforului radioactiv și A. a făcut posibilă detectarea prezenței unui metabolism intens într-un os în creștere; utilizarea iodului radioactiv și A. a făcut posibilă clarificarea tiparelor de activitate ale glandei tiroide; introducerea compușilor marcați – precursori ai proteinelor și acizilor nucleici, iar A. a ajutat la înțelegerea rolului anumitor structuri celulare în schimbul acestor compuși vitali. Metoda A. face posibilă determinarea nu numai a localizării unui radioizotop într-un obiect biologic, ci și a cantității acestuia, deoarece numărul de boabe reduse de argint din emulsie este proporțional cu numărul de particule care acționează asupra acestuia. Analiza cantitativă a macroautografelor este efectuată prin metodele obișnuite de fotometrie (vezi Fotometria) ,
și microautografe - prin numărarea la microscop a boabelor de argint sau a urmelor-urme care au apărut în emulsie sub acțiunea particulelor ionizante. A. începe să se combine cu succes cu microscopia electronică (vezi microscopia electronică). Vezi și Radiografie. Lit.: Boyd D. A. Autoradiografia în biologie și medicină, trad. din engleză, M., 1957; Zhinkin L. N., Utilizarea izotopilor radioactivi în histologie, în cartea: Radiotracers in histology, L., 1959, p. 5-33; Perry R., Autoradiografie cantitativă, Methods in Cell Physiology, 1964, v. eu, cap. 15, p. 305-26. N. G. Hrușciov. Orez. 2. Autoradiogramă (tipărire) care arată distribuția fosforului (32 P) în frunzele de roșii. Planta a fost introdusă anterior într-o soluție care conținea fosfor radioactiv. Zonele luminoase corespund unor concentrații ridicate ale izotopului radioactiv; se poate observa că fosforul este concentrat la tulpină și în părțile vasculare ale frunzelor. Orez. 1. Microradiograma unei probe de nichel. Se studiază difuzia staniului marcat cu izotopul radioactiv 113 Sn în nichel. Distribuția staniului radioactiv arată că difuzia are loc în principal de-a lungul granițelor de granule ale nichelului.
Marea Enciclopedie Sovietică. - M.: Enciclopedia Sovietică. 1969-1978 .
Sinonime:Vedeți ce este „Autoradiografia” în alte dicționare:
- (din auto ... și radiografie) o metodă de înregistrare a distribuției substanțelor radioactive într-un obiect. Un film cu o emulsie sensibilă la radiații este aplicat pe suprafață (tăiat). Substanțele radioactive, parcă, își fac fotografii ... ... Dicţionar enciclopedic mare
- (radioautografia), o metodă de măsurare a distribuției de radioact. c c în obiectul studiat (după propria radiaţie), constând în aplicarea unui strat de emulsie fotografică nucleară pe acesta. Distribuția este determinată de densitatea înnegririi dezvoltate ...... Enciclopedia fizică
O metodă pentru studierea distribuției substanțelor radioactive (izotopi) într-un obiect sau compuși aflați în studiu. Constă în impunerea unui obiect (sau, de exemplu, unei cromatograme) a unei emulsii fotografice sensibile la radiațiile radioactive și obținerea unei amprente, ... ... Dicţionar de microbiologie
Există., număr de sinonime: 4 autoradiografie (2) macroautoradiografie (1) ... Dicţionar de sinonime
Autoradiografie. Vezi radioautograf. (Sursa: „Dicționar explicativ englez rusesc al termenilor genetici”. Arefiev V.A., Lisovenko L.A., Moscova: Editura VNIRO, 1995) ... Biologie moleculară și genetică. Dicţionar.
autoradiografie- Metodă de studiere a distribuţiei radioactului. componente din proba supusă studiului prin propria radiaţie prin impunerea probei sensibile la actul radioactiv. radiații de emulsie. Distribuția este determinată de densitatea înnegririi dezvoltate ...... Manualul Traducătorului Tehnic
Autoradiografie- * autoradiografie * autoradiografie vezi... Genetica. Dicţionar enciclopedic
- (din auto ... și radiografie), o metodă de înregistrare a distribuției substanțelor radioactive într-un obiect. Un film cu o emulsie sensibilă la radiații este aplicat pe suprafață (tăiat). Substanțele radioactive, parcă, își fac fotografii ... ... Dicţionar enciclopedic
Cărți
- Autoradiografia în biologie și medicină, J. Boyd, Cartea aparține unuia dintre creatorii metodei autoradiografiei. Primele opt capitole sunt dedicate teoriei întrebării. Ei iau în considerare teoria procesului fotografic, proprietățile și caracteristicile ... Categorie: Fundamentele cunoștințelor medicale Editor:
Radio-autografia este o metodă relativ nouă, care a extins enorm posibilitățile atât ale microscopiei luminoase, cât și ale microscopiei electronice. Aceasta este o metodă extrem de modernă, datorită dezvoltării fizicii nucleare, care a făcut posibilă obținerea de izotopi radioactivi ai diferitelor elemente. Pentru radioautografie, în special, izotopi ai acelor elemente care sunt utilizate de celulă sau se pot lega de substanțe utilizate de celulă și care pot fi administrați animalelor sau adăugați la culturi în cantități care nu interferează cu metabolismul celular normal. Deoarece un izotop radioactiv (sau o substanță marcată cu acesta) participă la reacțiile biochimice în același mod ca omologul său neradioactiv și, în același timp, emite radiații, calea izotopilor în organism poate fi urmărită folosind diferite metode de detectare. radioactivitate. O modalitate de a detecta radioactivitatea se bazează pe capacitatea sa de a acționa asupra filmului fotografic precum lumina; dar radiația radioactivă pătrunde în hârtia neagră folosită pentru a proteja filmul de lumină și are același efect asupra filmului ca și lumina.
Pentru a putea detecta radiațiile emise de izotopii radioactivi pe preparatele destinate studiului cu ajutorul microscoapelor cu lumină sau electronică, preparatele sunt acoperite într-o cameră întunecată cu o emulsie fotografică specială, după care sunt lăsate ceva timp în întuneric. Apoi diapozitivele sunt dezvoltate (tot în întuneric) și fixate. Zonele medicamentului care conțin izotopi radioactivi afectează emulsia aflată deasupra lor, în care „boabe” întunecate apar sub acțiunea radiației emise. Astfel, ei primesc autografe radio (din limba greacă. radio- radiant autoturisme- eu însumi și grapho- scrie).
La început, histologii aveau doar câțiva izotopi radioactivi; de exemplu, multe dintre primele studii care au folosit autoradiografia au folosit fosfor radioactiv. Mult mai mulți dintre acești izotopi au fost utilizați ulterior; Izotopul radioactiv al hidrogenului, tritiul, a găsit o utilizare deosebit de răspândită.
Autoradiografia a fost și este încă folosită pe scară largă pentru a studia unde și cum apar anumite reacții biochimice în organism.
Compușii chimici marcați cu izotopi radioactivi care sunt utilizați pentru studiul proceselor biologice sunt numiți precursori. Precursorii sunt de obicei substanțe asemănătoare celor pe care organismul le primește din alimente; ele servesc ca blocuri de construcție pentru construirea țesuturilor și sunt încorporate în componentele complexe ale celulelor și țesuturilor în același mod în care blocurile de construcție neetichetate sunt încorporate în ele. Componenta de țesut în care este încorporat precursorul marcat și care emite radiații se numește produs.
Celulele crescute în cultură, deși de același tip, se vor afla în stadii diferite ale ciclului celular la un moment dat, cu excepția cazului în care se acordă o atenție deosebită sincronizarii ciclurilor lor. Cu toate acestea, prin injectarea de tritiu-timidină în celule și apoi realizarea de autografe, este posibil să se determine durata diferitelor etape ale ciclului. Momentul de apariție a unei etape - mitoza - poate fi determinat fără timidină marcată. Pentru a face acest lucru, o probă de celule din cultură este ținută sub observație într-un microscop cu contrast de fază, ceea ce face posibilă monitorizarea directă a cursului mitozei și stabilirea calendarului acesteia. Durata mitozei este de obicei de 1 oră, deși în unele tipuri de celule durează până la 1,5 ore.
Metoda radio-autografiei
Radio-autografie, definiție, istorie.
Metoda de autoradiografie se bazează pe introducerea unui compus „etichetat” cu un atom radioactiv în obiectul studiat și identificarea locului includerii acestuia prin înregistrarea fotografică a radiației. Baza pentru obținerea unei imagini este efectul particulelor ionizante formate în timpul dezintegrarii unui atom radioactiv asupra unei emulsii fotografice nucleare care conține cristale de halogenură de argint.
Descoperirea metodei de autoradiografie este direct legată de descoperirea fenomenului de radioactivitate. În 1867 a fost publicată prima observație privind efectul sărurilor de uraniu asupra halogenurilor de argint (Niepce de St.Victor). În 1896, Henry Becquerel a observat iluminarea unei plăci fotografice cu săruri de uraniu fără expunere prealabilă la lumină. Acest experiment este considerat momentul descoperirii fenomenului de radioactivitate. Autoradiografia aplicată materialului biologic a fost folosită pentru prima dată de Lacassagne și Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) în anii 1920; blocul histologic de la diferite organe ale animalelor după introducerea izotopilor a fost presat cu partea sa plată pe placa de raze X și expus. O secțiune histologică a fost pregătită în prealabil și supusă unei proceduri standard de colorare. Autograful rezultat a fost studiat separat de tăietură. Această metodă face posibilă estimarea intensității încorporării izotopilor într-o probă biologică. În anii 1940, Leblond a folosit autoradiografia pentru a demonstra distribuția izotopului de iod în secțiuni ale glandei tiroide (Leblond C.P. 1943).
Primele încercări de a combina autoradiografia cu microscopia electronică au fost făcute în anii 1950 (Liquir-Milward, 1956). Autoradiografia microscopică electronică este un caz special de autoradiografie convențională, în care se numără și boabele de argint și se ia în considerare distribuția lor. Particularitatea metodei este utilizarea unui strat foarte subțire de emulsie. În prezent, s-a atins o rezoluție de aproximativ 50 nm, care este de 10-20 de ori mai mare decât la microscopia cu lumină.
În prezent, metoda autoradiografiei a fost completată cu posibilitatea estimării automate a numărului de boabe de argint cu ajutorul analizoarelor video. Adesea, pentru a amplifica semnalul etichetei (de regulă, aceștia sunt izotopi de înaltă energie), se folosesc diferite tipuri de scintilatoare, depuse pe plăci (ecran de intensificare acoperit cu fosfor) sau impregnate într-o emulsie (PPO) - în acest caz , emisia de fotoni iluminează o placă sau o peliculă fotografică convențională.
Principiul fotografic al obținerii unei imagini, emulsie fotografică
Într-un studiu radiografic, rolul unui detector de dezintegrare nucleară este îndeplinit de o emulsie fotografică, în care, atunci când trece o particulă ionizantă, rămâne o imagine latentă, care este apoi dezvăluită în timpul dezvoltării, similar procesării filmului fotografic obișnuit.
Fotoemulsia este o suspensie de microcristale de halogenură de argint în gelatină. Microcristalele au defecte structurale numite centri de sensibilitate. Conform modelului Gurney-Mott, aceste perturbări în rețeaua ionică a unui cristal sunt capabile să capteze electroni eliberați atunci când o particulă alfa sau beta trece prin banda de conducție a cristalului, în urma căreia ionul este convertit într-un atom. . Imaginea latentă rezultată poate fi dezvăluită printr-o procedură care transformă cristalele de halogenură de argint activate în granule de argint metalic (acest proces se numește dezvoltare chimică). Orice agent cu activitate reducătoare suficientă poate fi utilizat ca dezvoltator (de obicei, metol, amidol sau hidrochinonă sunt utilizate în fotografie și autoradiografie). După expunerea cristalelor expuse, microcristalele de halogenură de argint rămase sunt îndepărtate din emulsie cu un fixativ (de obicei hiposulfit). Emulsiile fotografice nucleare se caracterizează prin rezoluție (granulație) și sensibilitate. Prima este determinată de dimensiunea microcristalelor de sare de argint și este invers proporțională cu cea din urmă. Emulsia fotografică se caracterizează printr-o sensibilitate redusă la lumina vizibilă, dar lucrul cu ea, totuși, trebuie făcut în întuneric pentru a exclude apariția artefactelor.
Emulsia poate fi aplicată pe medicament sub formă de film finit cu un substrat sau prin scufundarea medicamentului într-o emulsie lichidă încălzită - astfel se obține un strat uniform subțire, care se dezvoltă în mod obișnuit. Înainte de aplicarea emulsiei pentru microscopie ușoară, lama este de obicei colorată cu colorația histologică dorită, dar mai palid decât de obicei, pentru a permite numărarea granulelor de argint în toate zonele. Medicamentul este expus pentru un anumit timp, apoi este dezvoltat.
Izotopi folosiți în autoradiografie.
În autoradiografie, în funcție de obiectivele studiului și de materialele disponibile, se pot utiliza diverși izotopi. Imaginea creată de o particulă ionizantă pe o emulsie fotografică nucleară depinde de energia particulei și de tipul interacțiunii acesteia cu materia.
Particulele alfa emise de nuclee radioactive identice au aceeași energie ( E) și aceeași lungime a drumului ( R) , legat de următoarea relație:
R = kE3/2
Unde k – o constantă care caracterizează mediul în care se propagă particulele. Gama de particule din inimă este determinată de densitatea și compoziția sa elementară. Relația Bragg-Klymen face posibilă estimarea intervalului dintr-o substanță cu masă atomică A și densitate prin intervalul de particule alfa din aer (R0) d:
R= 0,0003 (R0 / d) A1/2
Deoarece puterea de ionizare a particulelor alfa este foarte mare, acest lucru facilitează înregistrarea fotografică a distribuției izotopilor și permite, de asemenea, utilizarea materialelor non-emulsii pentru înregistrare. Urma particulelor alfa emisă de o singură sursă, pe autografe, arată ca un fascicul de segmente drepte, de obicei lungi de 15-50 de microni, care emană dintr-un punct, ceea ce vă permite să localizați cu precizie locul includerii unei etichete radioactive. Cu toate acestea, particulele alfa sunt emise de izotopi cu numere atomice mari, ceea ce limitează utilizarea lor ca etichetă biologică.
Urmele particulelor alfa sunt adesea observate în radiografiile histologice ca un artefact - rezultatul autoradierii izotopilor din lama de sticlă.
Radiația beta este caracterizată printr-un spectru continuu al energiei inițiale a particulelor - de la zero la E max determinat pentru fiecare izotop. Formele spectrului diferă semnificativ. Astfel, cea mai probabilă energie a particulelor emise de tritem este 1/7 din E max, 14C - aproximativ ¼, 32P - aproximativ 1/3. Energia maximă a radiației beta a diferiților izotopi variază de la 18 keV la 3,5 MeV - într-un interval mult mai larg decât radiația alfa. De regulă, energia maximă este mai mare pentru izotopii de scurtă durată.
Trecerea particulelor beta și a electronilor monoenergetici prin materie este însoțită de două tipuri principale de interacțiuni. Când interacționează cu un electron în orbită, particula îi poate transfera energie suficientă pentru a ioniza atomul (scoate electronul de pe orbită). În cazuri rare, această energie este atât de mare încât poate fi observată traseul electronului eliberat. Datorită egalității maselor particulei și electronului, există o abatere de la mișcarea inițială. Interacțiunea celui de-al doilea tip, cu nucleele atomice, duce la apariția razelor X bremsstrahlung. Deși aceasta din urmă nu este înregistrată de emulsie, actul de interacțiune a particulei cu nucleul poate fi detectat printr-o rupere bruscă a traiectoriei.
Interacțiunea repetată cu electronii care orbitează duce la o curbură a traiectoriei, care de obicei arată ca o linie de înfășurare, mai ales în partea finală, când viteza particulei scade și puterea de ionizare crește. Lungimea traiectoriei depășește vizibil distanța de la începutul până la punctul final al pistei - alergarea. Din acest motiv, chiar și electronii monoenergetici sunt caracterizați prin prezența unui interval de intervale limitate de sus de R max, ceea ce este tipic pentru această radiație. Din cauza pierderilor de ionizare mai mici, particulele beta sunt mai greu de detectat decât particulele alfa. Ele nu formează urme continue (cu excepția celei mai moi radiații de tritiu - cu toate acestea, în acest caz, probabilitatea de a trece prin mai mult de un cristal de emulsie este mică), densitatea și numărul de cristale dezvoltate variază în limite diferite. Intervalul unei particule beta dintr-un alt element poate fi estimat din formula:
R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)
Într-o gamă largă de valori ale lui E max kilometrajul maxim este legat de energia maximă prin relația:
R m= 412 E max 1,265 – 0,0954 lnE max
Diferența dintre intervale, capacitatea de ionizare și densitatea cristalelor de emulsie dezvoltate pentru particule cu energii diferite pot fi utilizate pentru a discrimina distribuția elementelor dacă izotopii acestora diferă semnificativ în E max, ca în cazul tritiului și 14C. Discriminarea distribuției a doi izotopi se realizează prin aplicarea a două straturi de emulsie pe probă, primul strat înregistrează predominant radiații moi, al doilea - dur. Conform unor lucrări, diferiți izotopi pot fi separați în mod fiabil de dimensiunea cristalelor de emulsie dezvoltate - cristalele afectate de particulele beta de tritiu, care are o putere de ionizare mai mare, sunt mai mari.
Electronii de conversie internă se formează atunci când este absorbit un quantum gamma cu o energie de radiație foarte scăzută și un electron este îndepărtat din învelișul interior al unui atom. Acești electroni sunt similari cu particulele beta moi, dar, spre deosebire de acestea din urmă, sunt monoenergetici. Prezența electronilor de conversie internă permite utilizarea izotopilor precum 125I.
În prezent, cei mai des utilizați izotopi care emit particule beta. De regulă, tritiul este utilizat pentru etichetare în studiile histologice. Primele autografe folosind tritiu au fost făcute încă din anii 1950 (Fitzgerald et al. 1951), dar utilizarea sa pe scară largă a început după ce timidina marcată cu tritiu a fost obținută la Brookhaven Laboratory. Deoarece hidrogenul face parte din toate substanțele organice, folosind tritiu, puteți obține o varietate de compuși care poartă o etichetă radioactivă. Cu cât energia particulei emise este mai mică, cu atât este mai scurtă urma lăsată de aceasta atunci când se deplasează într-o emulsie fotografică și cu atât mai precis este posibil să se localizeze locația atomului marcat. Lungimea traiectoriei particulelor de tritiu beta este de aproximativ 1-2 μm, cea mai probabilă energie este de 0,005 MeV, iar traseul constă în majoritatea cazurilor dintr-un singur bob de argint, ceea ce face posibilă localizarea sursei de radiație nu numai în celulele relativ mari. structuri, cum ar fi nucleul, dar și în cromozomi individuali.
Introducerea metaboliților „etichetați” în organism face posibilă urmărirea încorporării izotopului în celulele țesuturilor animale, ceea ce face posibilă studierea unei varietăți de procese biochimice într-un organism viu.
Obținerea datelor absolute - concentrația substanței marcate în obiectul studiat este rareori scopul cercetării radioautografice, pentru aceasta este necesar să se cunoască o serie de condiții, a căror determinare este dificilă. Prin urmare, studiile radioautografice cantitative sunt de obicei efectuate prin compararea concentrației de boabe de argint peste obiectul de testat și controlul, în timp ce datele de control sunt luate în mod convenabil ca una sau 100%.
Caracteristicile unor izotopi utilizați
în radioautografia obiectelor biologice
Metoda radio-autografiei
Radio-autografie, definiție, istorie.
Metoda de autoradiografie se bazează pe introducerea unui compus „etichetat” cu un atom radioactiv în obiectul studiat și identificarea locului includerii acestuia prin înregistrarea fotografică a radiației. Baza pentru obținerea unei imagini este efectul particulelor ionizante formate în timpul dezintegrarii unui atom radioactiv asupra unei emulsii fotografice nucleare care conține cristale de halogenură de argint.
Descoperirea metodei de autoradiografie este direct legată de descoperirea fenomenului de radioactivitate. În 1867 a fost publicată prima observație privind efectul sărurilor de uraniu asupra halogenurilor de argint (Niepce de St.Victor). În 1896, Henry Becquerel a observat iluminarea unei plăci fotografice cu săruri de uraniu fără expunere prealabilă la lumină. Acest experiment este considerat momentul descoperirii fenomenului de radioactivitate. Autoradiografia aplicată materialului biologic a fost folosită pentru prima dată de Lacassagne și Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) în anii 1920; blocul histologic de la diferite organe ale animalelor după introducerea izotopilor a fost presat cu partea sa plată pe placa de raze X și expus. O secțiune histologică a fost pregătită în prealabil și supusă unei proceduri standard de colorare. Autograful rezultat a fost studiat separat de tăietură. Această metodă face posibilă estimarea intensității încorporării izotopilor într-o probă biologică. În anii 1940, Leblond a folosit autoradiografia pentru a demonstra distribuția izotopului de iod în secțiuni ale glandei tiroide (Leblond C.P. 1943).
Primele încercări de a combina autoradiografia cu microscopia electronică au fost făcute în anii 1950 (Liquir-Milward, 1956). Autoradiografia microscopică electronică este un caz special de autoradiografie convențională, în care se numără și boabele de argint și se ia în considerare distribuția lor. Particularitatea metodei este utilizarea unui strat foarte subțire de emulsie. În prezent, s-a atins o rezoluție de aproximativ 50 nm, care este de 10-20 de ori mai mare decât la microscopia cu lumină.
În prezent, metoda autoradiografiei a fost completată cu posibilitatea estimării automate a numărului de boabe de argint cu ajutorul analizoarelor video. Adesea, pentru a amplifica semnalul etichetei (de regulă, aceștia sunt izotopi de înaltă energie), se folosesc diferite tipuri de scintilatoare, depuse pe plăci (ecran de intensificare acoperit cu fosfor) sau impregnate într-o emulsie (PPO) - în acest caz , emisia de fotoni iluminează o placă sau o peliculă fotografică convențională.
Principiul fotografic al obținerii unei imagini, emulsie fotografică
Într-un studiu radiografic, rolul unui detector de dezintegrare nucleară este îndeplinit de o emulsie fotografică, în care, atunci când trece o particulă ionizantă, rămâne o imagine latentă, care este apoi dezvăluită în timpul dezvoltării, similar procesării filmului fotografic obișnuit.
Fotoemulsia este o suspensie de microcristale de halogenură de argint în gelatină. Microcristalele au defecte structurale numite centri de sensibilitate. Conform modelului Gurney-Mott, aceste perturbări în rețeaua ionică a unui cristal sunt capabile să capteze electroni eliberați atunci când o particulă alfa sau beta trece prin banda de conducție a cristalului, în urma căreia ionul este convertit într-un atom. . Imaginea latentă rezultată poate fi dezvăluită printr-o procedură care transformă cristalele de halogenură de argint activate în granule de argint metalic (acest proces se numește dezvoltare chimică). Orice agent cu activitate reducătoare suficientă poate fi utilizat ca dezvoltator (de obicei, metol, amidol sau hidrochinonă sunt utilizate în fotografie și autoradiografie). După expunerea cristalelor expuse, microcristalele de halogenură de argint rămase sunt îndepărtate din emulsie cu un fixativ (de obicei hiposulfit). Emulsiile fotografice nucleare se caracterizează prin rezoluție (granulație) și sensibilitate. Prima este determinată de dimensiunea microcristalelor de sare de argint și este invers proporțională cu cea din urmă. Emulsia fotografică se caracterizează printr-o sensibilitate redusă la lumina vizibilă, dar lucrul cu ea, totuși, trebuie făcut în întuneric pentru a exclude apariția artefactelor.
Emulsia poate fi aplicată pe medicament sub formă de film finit cu un substrat sau prin scufundarea medicamentului într-o emulsie lichidă încălzită - astfel se obține un strat uniform subțire, care se dezvoltă în mod obișnuit. Înainte de aplicarea emulsiei pentru microscopie ușoară, lama este de obicei colorată cu colorația histologică dorită, dar mai palid decât de obicei, pentru a permite numărarea granulelor de argint în toate zonele. Medicamentul este expus pentru un anumit timp, apoi este dezvoltat.
Izotopi folosiți în autoradiografie.
În autoradiografie, în funcție de obiectivele studiului și de materialele disponibile, se pot utiliza diverși izotopi. Imaginea creată de o particulă ionizantă pe o emulsie fotografică nucleară depinde de energia particulei și de tipul interacțiunii acesteia cu materia.
Particulele alfa emise de nuclee radioactive identice au aceeași energie ( E) și aceeași lungime a drumului ( R) , legat de următoarea relație:
R = kE 3/2
Unde k – o constantă care caracterizează mediul în care se propagă particulele. Gama de particule din inimă este determinată de densitatea și compoziția sa elementară. Relația Bragg-Klymen face posibilă, prin intervalul de particule alfa din aer (R 0), să se estimeze intervalul într-o substanță cu masă atomică A și densitate d:
R= 0,0003 (R0 / d) A 1/2
Deoarece puterea de ionizare a particulelor alfa este foarte mare, acest lucru facilitează înregistrarea fotografică a distribuției izotopilor și permite, de asemenea, utilizarea materialelor non-emulsii pentru înregistrare. Urma particulelor alfa emisă de o singură sursă, pe autografe, arată ca un fascicul de segmente drepte, de obicei lungi de 15-50 de microni, care emană dintr-un punct, ceea ce vă permite să localizați cu precizie locul includerii unei etichete radioactive. Cu toate acestea, particulele alfa sunt emise de izotopi cu numere atomice mari, ceea ce limitează utilizarea lor ca etichetă biologică.
Urmele particulelor alfa sunt adesea observate în radiografiile histologice ca un artefact - rezultatul autoradierii izotopilor din lama de sticlă.
Trecerea particulelor beta și a electronilor monoenergetici prin materie este însoțită de două tipuri principale de interacțiuni. Când interacționează cu un electron în orbită, particula îi poate transfera energie suficientă pentru a ioniza atomul (scoate electronul de pe orbită). În cazuri rare, această energie este atât de mare încât poate fi observată traseul electronului eliberat. Datorită egalității maselor particulei și electronului, există o abatere de la mișcarea inițială. Interacțiunea celui de-al doilea tip, cu nucleele atomice, duce la apariția razelor X bremsstrahlung. Deși aceasta din urmă nu este înregistrată de emulsie, actul de interacțiune a particulei cu nucleul poate fi detectat printr-o rupere bruscă a traiectoriei.
Interacțiunea repetată cu electronii care orbitează duce la o curbură a traiectoriei, care de obicei arată ca o linie de înfășurare, mai ales în partea finală, când viteza particulei scade și puterea de ionizare crește. Lungimea traiectoriei depășește vizibil distanța de la începutul până la punctul final al pistei - alergarea. Din acest motiv, chiar și electronii monoenergetici sunt caracterizați prin prezența unui interval de intervale limitate de sus de R max, ceea ce este tipic pentru această radiație. Din cauza pierderilor de ionizare mai mici, particulele beta sunt mai greu de detectat decât particulele alfa. Ele nu formează urme continue (cu excepția celei mai moi radiații de tritiu - cu toate acestea, în acest caz, probabilitatea de a trece prin mai mult de un cristal de emulsie este mică), densitatea și numărul de cristale dezvoltate variază în limite diferite. Intervalul unei particule beta dintr-un alt element poate fi estimat din formula:
R = R A1 (Z/A) A1 / (Z/A)
Într-o gamă largă de valori ale lui E max kilometrajul maxim este legat de energia maximă prin relația:
R m= 412 E max 1,265 – 0,0954 lnE max
Diferența dintre intervalele, capacitatea de ionizare și densitatea cristalelor de emulsie dezvoltate pentru particule cu energii diferite pot fi utilizate pentru a discrimina distribuția elementelor dacă izotopii acestora diferă semnificativ în E max, ca în cazul tritiului și 14 C. Discriminarea distribuția a doi izotopi se realizează prin aplicarea pe o probă a două straturi de emulsie, primul strat înregistrează predominant radiații moi, al doilea - dur. Conform unor lucrări, diferiți izotopi pot fi separați în mod fiabil de dimensiunea cristalelor de emulsie dezvoltate - cristalele afectate de particulele beta de tritiu, care are o putere de ionizare mai mare, sunt mai mari.
Electronii de conversie internă se formează atunci când este absorbit un quantum gamma cu o energie de radiație foarte scăzută și un electron este îndepărtat din învelișul interior al unui atom. Acești electroni sunt similari cu particulele beta moi, dar, spre deosebire de acestea din urmă, sunt monoenergetici. Prezența electronilor de conversie internă permite utilizarea izotopilor precum 125 I.
În prezent, cei mai des utilizați izotopi care emit particule beta. De regulă, tritiul este utilizat pentru etichetare în studiile histologice. Primele autografe folosind tritiu au fost făcute încă din anii 1950 (Fitzgerald et al. 1951), dar utilizarea sa pe scară largă a început după ce timidina marcată cu tritiu a fost obținută la Brookhaven Laboratory. Deoarece hidrogenul face parte din toate substanțele organice, folosind tritiu, puteți obține o varietate de compuși care poartă o etichetă radioactivă. Cu cât energia particulei emise este mai mică, cu atât este mai scurtă urma lăsată de aceasta atunci când se deplasează într-o emulsie fotografică și cu atât mai precis este posibil să se localizeze locația atomului marcat. Lungimea traiectoriei particulelor de tritiu beta este de aproximativ 1-2 μm, cea mai probabilă energie este de 0,005 MeV, iar traseul constă în majoritatea cazurilor dintr-un singur bob de argint, ceea ce face posibilă localizarea sursei de radiație nu numai în celulele relativ mari. structuri, cum ar fi nucleul, dar și în cromozomi individuali.
Introducerea metaboliților „etichetați” în organism face posibilă urmărirea încorporării izotopului în celulele țesuturilor animale, ceea ce face posibilă studierea unei varietăți de procese biochimice într-un organism viu.
Obținerea datelor absolute - concentrația substanței marcate în obiectul studiat este rareori scopul cercetării radioautografice, pentru aceasta este necesar să se cunoască o serie de condiții, a căror determinare este dificilă. Prin urmare, studiile radioautografice cantitative sunt de obicei efectuate prin compararea concentrației de boabe de argint peste obiectul de testat și controlul, în timp ce datele de control sunt luate în mod convenabil ca una sau 100%.
Caracteristicile unor izotopi utilizați
în radioautografia obiectelor biologice
Particulele beta de fosfor radioactiv sunt capabile să zboare pe distanțe de până la câțiva milimetri într-o emulsie nucleară, pista constă din zeci de particule de argint rar localizate - de exemplu, fosforul radioactiv poate fi folosit doar pentru a studia distribuția izotopului în țesuturi , localizarea în structurile celulare individuale nu poate fi stabilită.
Sulful radioactiv și carbonul pot fi utilizate pentru a localiza izotopul în celule individuale, cu condiția ca acestea să fie mari sau suficient de mult distanțate, ceea ce poate fi realizat în frotiuri de sânge sau suspensii de celule.
Rezoluție și erori de metodă, erori de metodă.
eroare geometrică– datorită faptului că particula emisă poate fi îndreptată sub orice unghi față de suprafața fotostratului. În consecință, granulele de argint din fotostratul s-ar putea să nu fie situat exact deasupra atomului radioactiv, ci mai mult sau mai puțin deplasat în funcție de direcția de mișcare a particulelor și de lungimea drumului (energie).
bug foto apare din cauza faptului că un grăunte de argint, format din mii de atomi de metal, este mult mai mare decât un atom radioactiv. Astfel, localizarea unui obiect mai mic trebuie judecată în funcție de poziția celui mai mare.
Atunci când se utilizează tritiu, care se caracterizează prin energie scăzută (kilometrajul) a particulelor emise și emulsii fotografice nucleare cu granulație mică, rezoluția metodei de autoradiografie se află în rezoluția sistemelor optice - 1 μm. Astfel, aceste erori nu au un impact semnificativ asupra rezultatului.
Pentru a obține o rezoluție mai bună, este necesar să se reducă grosimea tăieturii, stratul de emulsie și distanța dintre ele. Eșantionul trebuie să fie ușor subexpus.
Efect de absorbție automată: Numărul de boabe de argint depinde de gradul de absorbție a radiațiilor de către structurile celulare, datorită intervalului scăzut și energiei scăzute a particulelor beta, absorbția lor în țesuturi este destul de mare, ceea ce poate duce la pierderea semnului, astfel încât întrebarea de grosimea secțiunilor devine importantă. S-a demonstrat că numărul de boabe de argint este proporțional cu radioactivitatea țesuturilor doar la o grosime a feliei de cel mult 5 microni.
Numărul relativ de particule beta care au trecut prin stratul absorbant cu o grosime X poate fi estimat conform legii lui Baer -
N X/N 0 = e - m X
Unde m este coeficientul de absorbție (reversul grosimii stratului, în timpul căruia numărul de particule scade în e o singura data. Valoarea coeficientului de absorbție poate fi estimată aproximativ din valoarea lui R m(interval maxim), cunoscut pentru toți izotopii, folosind relația m R m= 10, care este valabil pentru radiații nu prea dure.
Dacă într-un strat de unitate de grosime pe unitate de timp există n particule care se deplasează spre suprafață, atunci într-o probă cu o grosime X suprafața va ajunge la N particule:
Fundal și artefacte: O eroare în măsurători poate fi introdusă și prin influențe mecanice - zgârieturi, fisuri de emulsie care duc la formarea unei imagini latente și radiații de fundal, care trebuie luate în considerare la prelucrarea autografelor. Fondul este luat în considerare prin numărarea numărului de boabe de argint din zona goală a preparatului. Erorile sunt introduse și ca urmare a prelucrării histologice a secțiunilor - cablaj pentru alcooli (deshidratare), înglobare de parafină, colorare. Aceste proceduri pot afecta dimensiunea și raportul structurilor celulare.
Efectul radiațiilor al metaboliților marcați: Datorită energiei radiațiilor scăzute, tritiul provoacă ionizare semnificativă în celulă, mult mai mare decât efectul radiativ al particulelor beta de carbon. Ca rezultat, cu acțiunea prelungită a unui compus marcat, de exemplu, 3H-timidină, celulele sunt distruse și mor, ducând la oprirea creșterii tisulare. În primul rând, spermatogeneza este perturbată. Există dovezi ale efectelor mutagene și carcinogene ale metaboliților marcați. Modificările citologice observate constau în perturbarea trecerii ciclului mitotic de către celule, modificări ale ploidiei celulare și apariția aberațiilor cromozomiale. Dar, aparent, efectul dăunător al izotopului asupra celulelor poate afecta semnificativ rezultatele studiului numai în condițiile unui experiment lung.
Cuantificarea radioactivitatii
De regulă, nu valoarea absolută, ci cantitatea relativă a izotopului inclus este determinată în experiment. Gradul de includere a etichetei poate fi evaluat în două moduri - densitometric - care este mai aplicabil la macroautografe și la numărarea directă a boabelor de argint peste obiecte. Această procedură consumatoare de timp poate fi efectuată în prezent folosind un computer. O imagine digitală a unui preparat histologic este procesată de un software special pentru a evidenția automat celulele și structurile celulare de pe acesta și pentru a număra numărul de boabe de argint. Dacă se pune problema evaluării cantitative, este necesar să se implice conceptul de eficiență. Cel mai adesea, eficiența este înțeleasă ca numărul de boabe de argint formate în timpul înregistrării unei dezintegrari radioactive. Eficacitatea metodei este influențată de mulți factori, în primul rând grosimea obiectului și emulsia.
În studiile care au folosit un contor de scintilație, s-a găsit o corelație ridicată între numărul mediu de dezintegrari pe minut și numărul de boabe de argint. Conform lui Hunt (Hunt și Foote, 1967), formarea unui bob în emulsia utilizată în experiment corespunde la 5,8 dezintegrari radioactive, adică eficiența metodei este de 17,8%.
Pentru cuantificarea tritiului din preparatele macroscopice se pot folosi mostre cu activitate standard, care sunt montate pe acelasi autograf.
O evaluare precisă a radioactivității obiectelor biologice comparate este foarte dificilă.
Un exemplu clasic de studiu radioautografic este lucrarea privind acumularea de 32 P în ADN-ul celulelor rădăcinii de fasole de cal (Howard și Pelc, 1953). În acest experiment, s-a arătat pentru prima dată împărțirea ciclului mitotic în patru perioade (mitoză - M, G 1 - perioada presintetică, S - sinteza ADN, perioada premitotică G 2), că perioada de sinteză a ADN-ului ocupă o perioadă limitată. parte a interfazei, fiind separate în timp de începutul și sfârșitul mitozei. Datele lui Howard și Pelk au găsit mai târziu confirmarea în experimente mai precise folosind un precursor ADN specific, 3H-timidină.
Metode de evaluare a sintezei proteinelor. Cei mai comuni precursori pentru evaluarea sintezei totale a proteinelor în studiile radioautografice sunt 3H-leucina, 3H-metionina, 3H-fenilalanina. De exemplu, sinteza proteinelor totale în creierul șobolanilor în primele săptămâni de dezvoltare postnatală a fost studiată folosind o etichetă de leucină (Pavlik și Jakoubek, 1976). Pentru a studia sinteza histonelor și efectul lor asupra reglarii transcripției, se folosesc aminoacizii de bază 3 H-lizină și 3 H-arginina, iar 3 H-triptofan este utilizat pentru studiul sintezei proteinelor acide. Densitatea de includere a etichetei de aminoacizi corespunde intensității sintezei proteinelor și, prin urmare, reflectă activitatea funcțională a neuronului. Metoda radioautografică face posibilă compararea caracteristicilor sintezei proteinelor în diferite țesuturi animale sub expunere experimentală și ne permite să urmărim dinamica modificărilor la nivelul tipurilor individuale de celule și structurilor celulare (nucleu, corp celular, procese neuronale - axonale). transport).
În prezent, autoradiografia este adesea folosită pentru a studia creierul în studiile care utilizează radioliganzi pentru anumiți receptori. Astfel, au fost construite hărți ale distribuției diverșilor receptori în structurile creierului animalelor și oamenilor.
Autoradiografia este, de asemenea, utilizată pentru vizualizarea gelurilor în biochimie și în combinație cu imunotestele (RIA).
Referinte:
1. Epifanova O.I. et al. Autograf radiofonic M., Școala superioară, 1977
2. Sarkisov D.S. Perov Yu.L. Tehnica microscopică M.: „Medicina”, 1996
3.Rogers A.W. Autoradiografie practică, Amersham Marea Britanie, 1982
4.Bokshtein S.Z. Ginzburg S.S. et al. Autoradiografia electron-microscopică în știința metalelor M., „Metalurgie”
Autoradiograma A fiya, autoradiografie, autoradiografie , o metodă de studiere a distribuției substanțelor radioactive într-un obiect aflat în studiu prin impunerea asupra obiectului a unei emulsii fotografice sensibile la radiațiile radioactive. Substanțele radioactive conținute în obiect făcându-se poze(de aici și numele). Metoda autoradiografiei este utilizată pe scară largă în fizică și tehnologie, în biologie și medicină, oriunde se folosesc trasori izotopi.
Dupa dezvoltarea si fixarea emulsiei fotografice se obtine pe aceasta o imagine care afiseaza distributia studiata. Există mai multe moduri de a aplica emulsie fotografică pe un obiect. O placă fotografică poate fi aplicată direct pe suprafața lustruită a probei sau o emulsie lichidă caldă poate fi aplicată pe eșantion, care, atunci când se solidifică, formează un strat strâns adiacent probei și este examinată după expunere și prelucrare foto. Distribuția substanțelor radioactive este studiată prin comparație densitatea de înnegrire a filmului din proba de testare și de referință(așa-numita macroradiografie).
A doua metodă constă în numărarea urmelor formate de particule ionizante într-o emulsie fotografică, folosind optic sau microscop electronic (microradiografie). Această metodă este mult mai sensibilă decât prima. Pentru obținerea de macroautografe se folosesc emulsii de transparență și raze X, iar emulsii speciale cu granulație fină sunt folosite pentru microautografe.
Se numește o imagine fotografică a distribuției substanțelor radioactive în obiectul studiat, obținută prin autoradiografie autoradiogramă sau radioautograf.
Introducerea compușilor marcați cu radioizotopi în organism și examinarea ulterioară a țesuturilor și celulelor prin autoradiografie permite:
- obține informații exacte despre care celule sau structuri celulare, apar anumite procese,
- substanțe localizate,
- setați parametrii de timp pentru un număr de procese.
De exemplu, utilizarea fosforului radioactiv și a autoradiografiei au făcut posibilă detectarea prezenței unui metabolism intens în osul în creștere; utilizarea iodului radioactiv și a autoradiografiei au făcut posibilă clarificarea tiparelor de activitate ale glandei tiroide; introducerea compușilor marcați - precursori ai proteinelor și acizilor nucleici, și autoradiografia au contribuit la clarificarea rolului anumitor structuri celulare în schimbul acestor compuși vitali. Metoda de autoradiografie face posibilă determinarea nu numai a localizării unui radioizotop într-un obiect biologic, ci și a cantității acestuia, deoarece numărul de granule de argint reduse ale emulsiei este proporțional cu numărul de particule care îl afectează. Analiza cantitativa macroautografele sunt efectuate prin metodele obișnuite de fotometrie, iar microautografele - prin numărarea la microscop a boabelor de argint sau a urmelor-urme care au apărut în emulsie sub acțiunea particulelor ionizante. Autoradiografia începe să fie combinată cu succes cu microscopia electronică
