Hidrólisis de proteínas determinación de la composición de aminoácidos. Composición de aminoácidos de las proteínas.
La síntesis de proteínas se produce en los ribosomas en forma de una estructura primaria, es decir, ubicado en un cierto número y en una cierta secuencia de aminoácidos conectados por enlaces peptídicos formados por grupos carboxilo y α-amino de residuos de aminoácidos vecinos El enlace peptídico es rígido, covalente, determinado genéticamente En fórmulas estructurales, se representa como un solo enlace: y el nitrógeno tiene el carácter de un enlace parcialmente doble:
La rotación a su alrededor es imposible y los cuatro átomos se encuentran en el mismo plano, es decir coplanario La rotación de otros enlaces alrededor del esqueleto del polipéptido es bastante libre.
La estructura primaria fue descubierta en 1898 por Danilevsky, profesor de la Universidad de Kazan. En 1913, Emil Fischer sintetizó los primeros péptidos.
Esta secuencia de aminoácidos es única para cada proteína y está fijada genéticamente. En violación del proceso de síntesis de la estructura primaria de la proteína en el ribosoma, pueden desarrollarse diversas enfermedades genéticas. Por ejemplo, cuando se alteran dos aminoácidos en la hemoglobina, se desarrolla anemia de células falciformes.
Para estudiar la composición de aminoácidos de las proteínas, se utiliza una combinación (o una de ellas) de hidrólisis ácida (HCl), alcalina (Ba (OH) 2) y, con menos frecuencia, enzimática. Se ha establecido que durante la hidrólisis de una proteína pura que no contiene impurezas, se liberan 20 a-aminoácidos diferentes. Todos los demás aminoácidos descubiertos en los tejidos de animales, plantas y microorganismos (más de 300) existen en la naturaleza en estado libre o en forma de péptidos cortos o complejos con otras sustancias orgánicas.
Los α-aminoácidos son derivados de los ácidos carboxílicos, en los que un átomo de hidrógeno, en el α-carbono, se reemplaza por un grupo amino (-NH2), por ejemplo: cabe destacar que todos los aminoácidos que componen las proteínas naturales son a-aminoácidos, aunque el grupo amino en los ácidos aminocarboxílicos libres puede estar, como veremos a continuación, en las posiciones β, γ, δ, ε.
9. Estructura secundaria de las proteínas: hélices α y estructuras β. Estructura y papel funcional de los dominios.
La estructura secundaria es la disposición espacial de la cadena polipeptídica en forma de hélice α o plegado β, independientemente de los tipos de radicales laterales y su conformación. Está estabilizado por enlaces de hidrógeno, que se cierran entre los grupos péptido, amida (-N-H) y carbonuro (-C=O), es decir se incluyen en la unidad peptídica, y puentes disulfuro entre residuos de cisteína
Pauling y Corey propusieron un modelo de estructura secundaria de la proteína en forma de hélice α levógira, en la que los enlaces de hidrógeno se cierran entre cada primer y cuarto aminoácido, lo que permite conservar la estructura nativa de la proteína, realizar sus funciones más simples y protegerlo de la destrucción. Hay 3,6 residuos de aminoácidos por vuelta de la hélice, el paso de la hélice es de 0,54 nm. Todos los grupos peptídicos participan en la formación de enlaces de hidrógeno, lo que garantiza la máxima estabilidad, reduce la hidrofilia y aumenta la hidrofobicidad de la molécula de proteína. La hélice alfa se forma espontáneamente y es la conformación más estable correspondiente a la energía libre mínima.
Pauling y Corey también propusieron otra estructura ordenada: una capa β plegada. A diferencia de la hélice α condensada, las capas β están casi completamente alargadas y pueden disponerse tanto en paralelo como en antiparalelo.
Los puentes disulfuro y los enlaces de hidrógeno también participan en la estabilización de estas estructuras.
Una estructura supersecundaria es un nivel superior de organización de una molécula de proteína, representada por un conjunto de estructuras secundarias que interactúan entre sí: hélice α: dos secciones antiparalelas que interactúan con superficies complementarias hidrofóbicas (de acuerdo con el principio de protuberancia hueca) αсα, superenrollamiento de elementos de hélice α (βхβ) en proteínas globulares, representados por dos cadenas β paralelas conectadas por un segmento x, elementos βαβαβ, representados por dos segmentos de hélice α insertados entre tres cadenas β paralelas.
Contenido Introducción 1. Los principales componentes de la leche 2. Métodos para el análisis de aminoácidos 1. Método cromatográfico de análisis 2. Método espectrofotométrico de análisis 3. Método volumétrico de análisis 4. Método electroquímico de análisis 3. Métodos para determinar el aminoácido composición 1. Determinación de aminoácidos por cromatografía en capa fina 3.2. Determinación de aminoácidos por método espectrofotométrico 4. Revisión de resúmenes de revistas Bibliografía Introducción El problema de la nutrición es uno de los problemas sociales más importantes.
La vida humana, la salud y el trabajo son imposibles sin una buena alimentación. De acuerdo con la teoría de la nutrición equilibrada, la dieta humana debe contener no solo proteínas, grasas y carbohidratos en la cantidad requerida, sino también sustancias como aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales en ciertas proporciones que sean beneficiosas para los humanos.
En la organización de una nutrición adecuada, el papel principal se le da a los productos lácteos. Esto se aplica completamente a la leche, cuyo valor nutricional se debe a la alta concentración de proteínas y grasas de la leche en ella, la presencia de aminoácidos esenciales, sales de calcio y fósforo, que son tan necesarios para el desarrollo normal del cuerpo humano. La fácil digestibilidad es una de las propiedades más importantes de la leche como producto alimenticio. Además, la leche estimula la absorción de nutrientes de otros alimentos.
La leche agrega variedad a la nutrición, mejora el sabor de otros productos y tiene propiedades terapéuticas y profilácticas. La leche contiene más de 120 componentes diferentes, incluidos 20 aminoácidos, 64 ácidos grasos, 40 minerales, 15 vitaminas, decenas de enzimas, etc. El valor energético de 1 litro de leche cruda es de 2797 kJ. Un litro de leche satisface el requerimiento diario de un adulto de grasas, calcio, fósforo, 53% de proteínas, 35% de vitaminas A, C y tiamina, y 26% de energía. El objetivo principal de este curso es identificar la composición de aminoácidos de la leche. una.
Principales componentes de la leche.
Desde el punto de vista fisicoquímico, la leche es un polidisp... 5.1). El mayor peso específico en la leche es el agua (más del 85%, el resto... El residuo seco incluye todos los nutrientes de la leche. Determina el rendimiento de los productos terminados en la producción de productos lácteos...
Método cromatográfico de análisis.
Uno de los métodos más prometedores es el método altamente eficiente... Pero las ventajas del método superan con creces sus desventajas. Además, se puede utilizar para completar el análisis químico.... En columnas capilares cromatográficas de gases modernas en un ex... El método se caracteriza por una alta sensibilidad y permite la cantidad de...
Método volumétrico de análisis
Método volumétrico de análisis. De los métodos volumétricos de determinación cuantitativa, el más amplio... La titulación se puede llevar a cabo con un indicador (cristal violeta... Sin embargo, este método tiene una serie de inconvenientes importantes: uso... Para el análisis cuantitativo de aminoácidos individuales , reunió ...
Método electroquímico de análisis.
En las últimas décadas, el... 3.. en condiciones optimizadas, se han generalizado cada vez más, permiten determinar solo am... Por lo tanto, se ha desarrollado un método para la determinación polarográfica de triptófano, basado en ... Un método electroquímico de análisis.
Métodos para determinar la composición de aminoácidos
Métodos para determinar la composición de aminoácidos 3.1.
Determinación de aminoácidos por cromatografía en capa fina
En 1 litro de agua destilada disuelva 84 g de ácido cítrico monohidrato... 3.2 Las muestras y los aminoácidos estándar se aplican a la línea de partida en la placa...
Determinación de aminoácidos por método espectrofotométrico
Aminoácidos, aminas primarias, polipéptidos y peptonas cuando se calientan con ... Se prepara una solución de ninhidrina al 0,2 - 3% en diferentes solventes (isobu ... 2007. K. 2. Tsvetkova N.D.
Qué haremos con el material recibido:
Si este material le resultó útil, puede guardarlo en su página en las redes sociales:
| Pío |
Más ensayos, trabajos finales, tesis sobre este tema:
Definición de entropía. Determinación de pérdidas de información en la transmisión de mensajes por canales de comunicación con ruido
Determinación de la esencia de BUU: sujeto y método. Se puede dar una definición aproximada del propósito de SP: proporcionar información que sea útil para la gestión de la organización.
Buu es parte del sistema de información de una empresa, por un lado, por el otro, una actividad cuyos objetivos son proporcionar información a la gestión.. se puede dar una definición aproximada del propósito de yy proporcionar información que.. la esencia de yy radica en la analiticidad de la información que es recolectada, agrupada, identificada y estudiada por yy ..
Estas pautas están destinadas a ayudar a los estudiantes a realizar trabajos de laboratorio sobre la descripción y definición de minerales y rocas. Estas pautas brindan la terminología y la metodología de descripción necesarias. Las pautas brindan opciones para tareas y ejemplos para realizar trabajos computacionales y gráficos en la construcción. .
Propiedad empresarial: composición, finalidad. Determinación de la necesidad de capital fijo y de trabajo
El capital de una empresa puede ser considerado desde varios puntos de vista, en primer lugar, conviene distinguir entre capital.
El corpus delicti nos permite distinguir unos de otros.. para referirnos a la composición, primero hay que mirar las causales del delito.. primero hay que averiguar cuáles son las causales del delito y luego lo haremos. mira que el unico terreno es..
Definición de entropía. Determinación de pérdidas de información en la transmisión de mensajes por canales de comunicación con ruido. Opciones de tareas para completar
La tarea es la definición de entropía .. el mensaje consta de n caracteres hay m tipos de caracteres el número de letras .. la tarea es la definición de pérdida de información al transmitir mensajes a través de canales de comunicación con ruido ..
Tareas para realizar clases prácticas en el curso de la tarea de contabilidad 1. Según la composición de la propiedad de OAO Rostov, agrupe los activos económicos de la propiedad por tipo y composición
Facultad de Contabilidad y Economía.. Khakhonova n.. tareas para realizar clases prácticas..
Principales clases de compuestos inorgánicos. Determinación de la masa molar de equivalentes de zinc. Determinación del calor de la reacción de neutralización. La velocidad de una reacción química. Catálisis
Introducción .. Al estudiar química, un taller de laboratorio es de gran importancia.. Un experimento correctamente configurado permite ..
Entorno Integrado y Composición del lenguaje Objeto Pascal. composición de la lengua
Contenidos.. Clase Entorno Integrado y Composición del lenguaje Object Pascal.. Trabajando con ventanas Edición en Object Pascal..
Introducción a los sistemas operativos. Definición, finalidad, composición y funciones de los sistemas operativos
Institución educativa estatal de educación profesional superior.Togliatti State University of Service..
En primer lugar, los enlaces peptídicos se destruyen por hidrólisis. Dado que los enlaces peptídicos son estables a pH neutro, se utiliza catálisis ácida o alcalina. La catálisis enzimática es menos adecuada para la hidrólisis completa. La hidrólisis completa de una proteína en sus aminoácidos constituyentes está inevitablemente acompañada por una pérdida parcial de algunos residuos de aminoácidos. Lo mejor para llevar a cabo
Arroz. 4.7. Filtración en gel de fragmentos de bromuro de cianógeno (CB) de globina fetal humana. La cromatografía se llevó a cabo en una columna Sephadex equilibrada con -HCOOH, seguida de elución con la misma solución. La numeración de los fragmentos de las cadenas a e y es arbitraria. (Cortesía de J. D. Pearson et al., Departamento de Bioquímica, Universidad de Purdue).
hidrólisis en 6 n. a 110°C en una ampolla al vacío. En estas condiciones, el triptófano se destruye completamente a cisteína y parcialmente a cistina. En presencia de metales se observa una pérdida parcial de metionina y tirosina. La glutamina y la asparagina se desamidan cuantitativamente a glutamato y aspartato. El contenido de serina y treonina también resulta subestimado, y en mayor medida cuanto más tiempo se lleva a cabo la hidrólisis. Finalmente, algunos enlaces entre residuos neutros se hidrolizan solo en un 50% incluso después de 20 h. Por lo general, las muestras repetidas se hidrolizan durante horas 24, 48, 72 y 96. Luego, los datos de serina y treonina se representan en una escala semilogarítmica y se extrapolan al tiempo cero. Para valina e isoleucina se utilizan los resultados obtenidos de la hidrólisis de 96 horas. Los ácidos dicarboxílicos y sus amidas se definen colectivamente y se notifican como "Glx" o "Asx". La cisteína y la cistina se convierten en derivados estables en ácido (por ejemplo, ácido cisteico) antes de la hidrólisis.
Arroz. 4.8. Cromatografía líquida de fase inversa de alta presión: perfil de elución de fragmentos de bromuro de cianógeno (CB) de globina fetal humana. La numeración de los fragmentos de las cadenas a e y es arbitraria. (Cortesía de J. D. Pearson et al. Departamento de Bioquímica, Universidad de Purdue).
Para el análisis de triptófano se realiza hidrólisis alcalina; en este caso se produce la destrucción de serina, treonina, arginina y cisteína y la racemización de todos los aminoácidos. Una vez completada la hidrólisis, la composición de aminoácidos se puede determinar mediante cromatografía automática de intercambio iónico (consulte la Figura 3.12) o cromatografía líquida a presión.
Se pueden distinguir los siguientes pasos para dilucidar la estructura primaria de proteínas y péptidos:
1. Aislamiento de proteínas en forma pura y determinación de su peso molecular
2. Determinación de la composición de aminoácidos
3. Determinación del aminoácido N-terminal
4. Determinación del aminoácido C-terminal
5. Determinación de la secuencia de aminoácidos
Aislamiento de proteína pura. Normalmente, el material de partida contiene muchas proteínas diferentes. Esto plantea el problema de aislar la proteína pura de interés de esta mezcla. Al purificar proteínas, se utilizan métodos que se basan en la diferencia:
1. Carga superficial de proteínas
2. Tamaño molecular de las proteínas (dependiendo de su peso molecular)
3. Actividad biológica debida a la unión a sustratos o inhibidores
Separación de proteínas según la diferencia en la magnitud de la carga superficial. La carga eléctrica superficial total de una proteína a un valor de pH dado puede ser negativa, neutra o positiva. Para separar proteínas con diferentes cargas, como fue el caso de los aminoácidos, se puede utilizar el método de cromatografía de intercambio iónico (ver arriba). La concentración de proteína en los tubos de ensayo con el eluato se determina usando un espectrofotómetro por la intensidad de absorción de la luz ultravioleta y se traza su dependencia gráfica del volumen de líquido que sale de la columna cromatográfica.
Separación de proteínas por peso molecular. Si imaginamos las moléculas de proteína como bolas de varios tamaños, cuyo tamaño depende de su peso molecular, resulta que las bolas grandes tendrán un peso molecular o tamaño molecular mayor. Esto significa que las proteínas se pueden separar como partículas en un tamiz, un tamiz molecular formado por un gel. Este método a menudo se llama filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño. A continuación se muestra una ilustración de cómo la filtración en gel puede separar una mezcla de proteínas de diferentes tamaños (Fig. 1.12).
La columna cromatográfica se llena con gel hinchado. Las partículas de gel están hechas de un material de polisacárido reticulado y contienen una gran cantidad de microporos. El tamaño de los microporos se selecciona de tal manera que las moléculas más pequeñas de las separadas penetren en ellos, mientras que las más grandes no pueden hacerlo. La mezcla de proteínas a separar se aplica en la parte superior de la columna y se eluye con una solución tampón. Arrastradas por la corriente del líquido descendente, las moléculas grandes, incapaces de penetrar en los poros de las partículas de gel, se moverán más rápido. Las moléculas más pequeñas penetran en los poros y permanecen allí. Si la solución que fluye de la columna se recolecta en porciones iguales en tubos de ensayo, resultará que las primeras porciones del líquido que fluye contendrán proteínas de gran tamaño y luego, de menor tamaño. Al ajustar el tamaño de los poros, se puede lograr la separación de una amplia variedad de mezclas de proteínas.
Figura 1.12. Representación esquemática de la separación de proteínas por filtración en gel.
Si tenemos en cuenta que el tamaño de una molécula depende del peso molecular, resulta que al separar las proteínas por filtración en gel, se puede determinar simultáneamente su peso molecular.
Figura 1.13. Gráfico de la dependencia del peso molecular de las proteínas con el volumen de su salida de la columna cromatográfica durante la filtración en gel.
El volumen de eluato que sale de la columna es inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular de la proteína. Así, basta con conocer el volumen de líquido en el que la proteína de interés salió de la columna para que, mediante un gráfico similar, se pueda determinar su peso molecular (fig. 1.13).
Otro método que te permite separar proteínas dependiendo de su peso molecular es electroforesis en gel(véase más arriba).
Ultracentrifugación. Si sacudes un recipiente lleno de arena y agua y luego lo colocas sobre una superficie plana, la arena se asentará rápidamente en el fondo debido a la fuerza de la gravedad. Con sustancias de alto peso molecular en solución, esto no sucederá, ya que el movimiento térmico (Browniano) conserva su distribución uniforme en solución. La sedimentación de macromoléculas, como granos de arena, ocurrirá solo si se someten a una aceleración significativa.
La determinación de la composición de aminoácidos de las proteínas puede realizarse por varios métodos: químico, cromatográfico, microbiológico e isotópico. Los métodos cromatográficos son los más utilizados.
Cromatografía en papel. La cromatografía en papel se utiliza para identificar los componentes de una mezcla de aminoácidos con di- y tri-péptidos obtenidos por hidrólisis parcial de proteínas y polipéptidos.
La hidrólisis se puede llevar a cabo por métodos ácidos, alcalinos o enzimáticos. El método ácido es el más utilizado (HCl 6 N, H 2 SO 4 8 N). La hidrólisis se lleva a cabo con calentamiento, a veces a presión elevada. Los indicadores del final de la hidrólisis pueden ser: el cese del crecimiento de grupos carboxilo o amina en el hidrolizado, o una reacción de biuret negativa. El exceso de agente hidrolizante se elimina: el ácido sulfúrico se precipita con Ca(OH)2, el ácido clorhídrico se elimina por destilación al vacío y el ácido residual se precipita con nitrato de plata.
Los componentes del hidrolizado se distribuyen entre el agua adsorbida sobre la celulosa, que es la fase estacionaria, y el disolvente orgánico, la fase móvil, que sube o baja a lo largo de la lámina. Como fase móvil se utiliza una mezcla de butanol-ácido acético-agua (4:1:5). Cuanto más aminoácidos lipófilos son arrastrados más fuertemente por el disolvente orgánico, más hidrofílicos muestran una mayor tendencia a unirse a la fase estacionaria. Los compuestos homólogos que difieren incluso en una unidad de metileno se mueven a diferentes velocidades y se pueden separar fácilmente. Al final de la cromatografía, el papel se seca y se trata con un revelador (solución de ninhidrina al 0,5% en una mezcla de acetona-ácido acético glacial-agua) y se calienta durante varios minutos. Los aminoácidos aparecen como manchas coloreadas. Movilidad: una característica de valor constante de cada compuesto aumenta con el aumento del peso molecular. Para los aminoácidos de cadena lineal, la movilidad es algo mayor que para los isómeros correspondientes. La introducción de grupos polares en la molécula reduce la movilidad del compuesto. Los aminoácidos con cadenas laterales voluminosas no polares (leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano, etc.) se mueven más rápido que los aminoácidos con cadenas laterales no polares más cortas (prolina, alanina, glicina) o con cadenas laterales polares (treonina, arginina, cisteína, histidina, lisina). Esto se debe a la mayor solubilidad de las moléculas polares en la fase estacionaria hidrófila y de las no polares en los disolventes orgánicos.
La cromatografía en papel se puede utilizar para cuantificar el contenido de aminoácidos. Cada punto se extirpa y se eluye con un disolvente adecuado; luego realice un análisis colorimétrico cuantitativo (ninhidrina). En otra realización, el papel se rocía con ninhidrina y la intensidad del color de la mancha se mide usando un fotómetro en luz reflejada o transmitida. En una evaluación semicuantitativa, el contenido de aminoácidos se estima por el área de manchas en el cromatograma, que son proporcionales a las concentraciones de aminoácidos en la mezcla que se está separando.
Cromatografía de capa fina. La cromatografía en capa fina también se puede utilizar para separar y determinar los aminoácidos. TLC, como se sabe, existe en dos versiones. La TLC de partición es similar a la TLC de papel, y la TLC de adsorción se basa en principios completamente diferentes.
Al realizar RTLC en polvo de celulosa u otros medios relativamente inertes, se pueden usar los mismos sistemas de disolventes y reactivos de desarrollo que en la cromatografía en papel.
La separación mediante ATC está determinada por la capacidad del solvente (este solvente no es necesariamente una mezcla binaria o más compleja) para eluir los componentes de la muestra desde el lugar de su adsorción en el adsorbente activado. Por ejemplo, en gel de sílice calentado. ATLC es útil para separar compuestos no polares como lípidos, pero no para separar aminoácidos y la mayoría de los péptidos. Para separar los aminoácidos, se utiliza PTLC, que le permite separar y determinar rápidamente 22 aminoácidos de hidrolizados de proteínas.
Los aminoácidos en un hidrolizado de proteína también se pueden determinar mediante cromatografía de gases, pero los aminoácidos generalmente se convierten en compuestos volátiles antes del análisis cromatográfico.
Interacción con ninhidrina. Se forman los aldehídos correspondientes.
Así, se obtiene y analiza una mezcla de aldehídos. Este es el caso más simple, adecuado solo para algunos aminoácidos.
Convierten los aminoácidos en ésteres volátiles (ésteres alquílicos, ésteres metílicos de hidroxiácidos, ésteres metílicos de ácidos clorosustituidos, etc.).
La elección de los derivados depende de la mezcla de aminoácidos estudiada.
Cromatografía de intercambio de iones. Actualmente, la composición de aminoácidos de los productos alimenticios se determina exclusivamente mediante cromatografía automática de intercambio iónico.
| Cromatografía de intercambio de iones se basa en el intercambio estequiométrico reversible de iones en solución para iones que forman parte del intercambiador de iones (intercambiador de cationes, intercambiador de aniones) y en la diferente capacidad de los iones para separarse para el intercambio de iones con iones adsorbentes fijos formados como resultado de la disociación de grupos ionogénicos. Para los iones orgánicos, la interacción electrostática con cargas fijas del intercambiador de iones se superpone a la interacción hidrofóbica de la parte orgánica del ion con la matriz del intercambiador de iones. Para reducir su contribución a la retención de iones orgánicos y lograr la selectividad óptima de su separación, se agrega un componente orgánico (1–25 % de metanol, isopropanol, acetonitrilo) al eluyente acuoso. |
El método de Moore y Stein utiliza columnas cortas y largas llenas de resina de poliestireno sulfonado en forma de Na+. Cuando se aplica a la columna un hidrolizado ácido a pH=2, los aminoácidos se unen mediante intercambio catiónico con iones de sodio. A continuación, la columna se eluye con solución de citrato de sodio a pH y temperatura preprogramados. Una columna corta se eluye con un tampón, una columna larga con dos. El eluato se trata con ninhidrina, midiendo la intensidad del color usando un colorímetro de flujo. Los datos se graban automáticamente en la grabadora y se pueden transferir a una computadora para calcular el área bajo el pico.
Electroforesis de alto voltaje en portadores inertes. En bioquímica, la separación de aminoácidos, polipéptidos y otros anfolitos (moléculas cuya carga total depende del pH del medio) bajo la acción de un campo eléctrico constante superpuesto ha encontrado una amplia aplicación. Este es un método de electroforesis de alto voltaje en medios inertes. Cuando se separan los aminoácidos, las tiras de papel o las capas delgadas de polvo de celulosa se utilizan con mayor frecuencia como soportes inertes. La separación se lleva a cabo durante 0,5 a 2 h a un voltaje de 2000 a 5000 V, según las cargas totales de los anfolitos y sus pesos moleculares. Entre las moléculas que llevan la misma carga, las más ligeras migran más rápido. Pero un parámetro más importante en la separación es la carga total. El método se utiliza para separar aminoácidos, péptidos de bajo peso molecular, algunas proteínas, nucleótidos. La muestra se coloca en el soporte, se humedece con tampón al pH adecuado y se conecta al depósito de tampón con una tira de papel de filtro. El papel se cubre con una placa de vidrio o se sumerge en un solvente de hidrocarburo para que se enfríe. En un campo eléctrico, las moléculas que llevan una carga negativa a un pH dado migran hacia el ánodo y las que llevan una carga positiva migran hacia el cátodo. A continuación, el electroforegrama seco se "desarrolla" con ninhidrina (cuando se trabaja con aminoácidos, péptidos) o se mide la absorbancia en luz ultravioleta (cuando se trabaja con nucleótidos).
La elección del pH está determinada por los valores de pK de los grupos disociados que componen las moléculas de la mezcla. A pH 6,4, el glutamato y el aspartato tienen una carga de -1 y se mueven hacia el ánodo; su separación se lleva a cabo debido a la diferencia de peso molecular. La lisina, la arginina y la histidina se mueven en dirección opuesta, mientras que todos los demás aminoácidos que componen la proteína permanecen cerca del sitio de aplicación. Cuando se separan péptidos resultantes de la escisión enzimática, la reducción del pH a 3,5 conduce a un aumento de la carga de los grupos catiónicos y proporciona una mejor separación.
| Los aminoácidos llevan al menos dos grupos débilmente ionizados: -COOH y -NH 3 + . En solución, estos grupos se encuentran en dos formas, cargadas y sin carga, entre las cuales se mantiene el equilibrio protónico: R-COOH « R-COO - + H + R-NH 3 + « R-NH 2 + H + (ácidos y bases conjugados ) R -COOH y R-NH 3 + son ácidos débiles, pero el primero es varios órdenes de magnitud más fuerte. Por lo tanto, la mayoría de las veces (plasma sanguíneo, líquido intercelular pH 7.1–7.4) los grupos carboxilo están en forma de iones carboxilato, los grupos amino están protonados. Los aminoácidos en forma molecular (no disociada) no existen a ningún pH. Los valores de pK aproximados para un a-aminoácido y un grupo a-amino en un a-aminoácido son 2 y 10, respectivamente. La carga total (total) (la suma algebraica de todas las cargas positivas y negativas) de un aminoácido depende del pH, es decir, en la concentración de protones en solución. La carga de un aminoácido se puede cambiar variando el pH. Esto facilita la separación física de aminoácidos, péptidos y proteínas. El valor de pH en el que la carga total de un aminoácido es cero y, por lo tanto, no se mueve en un campo eléctrico constante se denomina punto isoeléctrico (pI). El punto isoeléctrico está en el medio entre los valores de pK más cercanos de los grupos que se disocian. |
Los métodos de papel, cromatografía en capa fina, microbiológicos, cromatografía de gases y muchos otros prácticamente no se utilizan en la actualidad debido a su menor reproducibilidad y larga duración. Los cromatógrafos modernos permiten determinar la composición de aminoácidos de una mezcla que contiene solo 10–7–10–9 mol de cada componente con una reproducibilidad de hasta el 5 % en 2–4 horas.
El análisis de la composición de aminoácidos incluye la hidrólisis completa de la proteína o péptido en estudio y la determinación cuantitativa de todos los aminoácidos en el hidrolizado. Dado que los enlaces peptídicos son estables a pH neutro, se utiliza catálisis ácida o alcalina. La catálisis enzimática es menos adecuada para la hidrólisis completa. La hidrólisis completa de una proteína en sus aminoácidos constituyentes está inevitablemente acompañada por una pérdida parcial de algunos residuos de aminoácidos. Para la hidrólisis, generalmente se usa 6N. solución acuosa de ácido clorhídrico (110ºС), en ampolla al vacío. La determinación cuantitativa de aminoácidos en el hidrolizado se lleva a cabo utilizando un analizador de aminoácidos. En la mayoría de estos analizadores, se separa una mezcla de aminoácidos en intercambiadores de cationes sulfónicos y la detección se realiza espectrofotométricamente por reacción con ninhidrina o fluorimétricamente con sobre-dialdehído ftálico.
Sin embargo, los datos sobre la composición de aminoácidos del mismo tipo de productos, obtenidos en diferentes laboratorios para aminoácidos individuales, a veces difieren hasta en un 50%.
Estas diferencias se deben no solo a diferencias varietales, de especie o tecnológicas, sino principalmente a la condición de hidrólisis del producto alimenticio. La hidrólisis ácida estándar (HCl 6 N, 110–120ºС, 22–24 horas) da como resultado la destrucción parcial de algunos aminoácidos, incluida la treonina, la serina (en un 10–15 % y más cuanto más se lleve a cabo la hidrólisis) y especialmente la metionina (30-60%) y cistina 56-60%, así como la destrucción casi completa de triptófano y cisteína. Este proceso se potencia en presencia de grandes cantidades de hidratos de carbono en el producto. Para la determinación cuantitativa de metionina y cistina, se recomienda preoxidarlas con ácido perfórmico. En este caso, la cistina se convierte en ácido cisteico y la metionina en metionina sulfona, que son muy estables durante la posterior hidrólisis ácida.
ácido cisteico cistina
Una tarea difícil en el análisis de aminoácidos es la determinación de triptófano. Como ya se mencionó, la hidrólisis ácida lo destruye casi por completo (hasta un 90%). Por tanto, para determinar el triptófano se lleva a cabo una de las variantes de hidrólisis alcalina de 2 N. NaOH, 100°C, 16–18 horas en presencia de cloruro estannoso al 5% o 2N hidróxido de bario, en el que se destruye ligeramente (hasta un 10%). Se produce una degradación mínima en presencia de ácido tioglicólico y almidón prehidrolizado. (La hidrólisis alcalina destruye la serina, la treonina, la arginina y la cisteína). El hidrolizado después de la neutralización con una mezcla de ácidos cítrico y clorhídrico se analiza inmediatamente (para evitar la formación de gel) en un analizador de aminoácidos. En cuanto a los numerosos métodos químicos para la determinación de triptófano, suelen ser poco reproducibles en productos alimenticios y por tanto no se recomienda su uso.
Para los productos cárnicos, un aminoácido necesario adicional es la hidroxiprolina, que caracteriza la cantidad de proteínas del tejido conectivo en la carne. Puede determinarse por cromatografía de intercambio iónico utilizando analizadores automáticos o por colorimetría química. El método se basa en la neutralización del hidrolizado ácido a pH 6,0, la posterior oxidación de la hidroxiprolina con una solución al 1,4% de cloramina T (o cloramina B) en una mezcla de alcohol propílico y tampón, determinación colorimétrica a 533 nm de la oxidación productos de hidroxiprolina después de la reacción con una solución al 10% de para-dimetilaminobenzaldehído en una mezcla de ácido perclórico y alcohol propílico (1:2).
Debido al hecho de que la tirosina, la fenilalanina y la prolina pueden oxidarse parcialmente en presencia de oxígeno, se recomienda que la hidrólisis ácida estándar se lleve a cabo en una atmósfera de nitrógeno. Varios aminoácidos, incluidos la leucina, la isoleucina y la valina, requieren una hidrólisis ácida más prolongada, de hasta 72 horas, para su completo aislamiento de las proteínas. En bioquímica, cuando se analizan las proteínas, se hidrolizan muestras paralelas durante 24, 48, 72 y 96 horas
Para una determinación cuantitativa precisa de todos los aminoácidos, se requieren 5 hidrólisis diferentes, lo que alarga mucho la determinación. Por lo general, se llevan a cabo 1-2 hidrólisis (estándar con ácido clorhídrico y con oxidación preliminar con ácido perfórmico).
Para evitar la pérdida de aminoácidos, la eliminación del exceso de ácido durante la hidrólisis ácida debe realizarse inmediatamente mediante evaporación repetida en un desecador al vacío con la adición de agua destilada.
Cuando el analizador funciona correctamente, las columnas de intercambio iónico funcionan sin cambiar la resina durante bastante tiempo. Sin embargo, si las muestras contienen cantidades apreciables de colorantes y lípidos, la columna se obstruirá rápidamente y se requerirán múltiples regeneraciones, a veces con reempaque de la columna, para restaurar sus capacidades de separación. Por lo tanto, para productos que contengan más de un 5% de grasa, se recomienda eliminar los lípidos por extracción previamente. La Tabla 2.3 muestra las condiciones para la preparación de muestras de productos alimenticios básicos en el análisis de la composición de aminoácidos.
Tabla 2.3. – Condiciones para la preparación de muestras de alimentos para el análisis
| Producto | Método de eliminación de lípidos | Proporción en peso de proteína: HCl (6M) |
| Concentrados de proteínas (aislados) | No requerido | 1:200 |
| Carne, pescado, conservas de carne y pescado, subproductos) | Extracción con 10 veces la cantidad de éter dietílico 3-4 veces o con una mezcla de etanol-cloroformo (1:2) 10 veces la cantidad 2 veces | 1:250 |
| Leche y productos lácteos | Extracción de 10 veces a una cantidad de muestra con una mezcla de etanol-cloroformo (1:2) 2 veces | 1:1000 |
| Granos y productos de cereales | No requerido | 1:1000 |
| productos a base de hierbas | No requerido | 1:500 |
| Carne y verduras y pescado y productos vegetales | Extracción con 10 veces la cantidad de éter dietílico 3-4 veces; con una mezcla de etanol-cloroformo (1:2) cantidad de 10 veces a una muestra 2 veces | 1:1000 |
| Huevo, productos de huevo | Extracción con una mezcla de etanol-cloroformo (1:2), 10 veces la cantidad de una muestra 2 veces | 1:200 |
Preguntas de prueba:
1. Definir el concepto de "proteínas".
2. ¿En qué grupos se dividen las proteínas según sus funciones en el cuerpo?
3. ¿Cuál es el papel de las proteínas en la nutrición humana?
6. ¿Qué aminoácidos esenciales conoces y qué aminoácidos pueden llegar a ser esenciales?
7. ¿Cómo se determina el contenido de nitrógeno total en los productos alimenticios?
8. ¿Cómo se determina la composición de aminoácidos de las proteínas?
9. ¿Qué métodos de determinación de aminoácidos conoces?
§ 2.4. carbohidratos
Los carbohidratos están ampliamente presentes en plantas y animales, donde realizan funciones tanto estructurales como metabólicas. En las plantas, en el proceso de fotosíntesis, la glucosa se sintetiza a partir del dióxido de carbono y el agua, que luego se almacena en forma de almidón o se convierte en celulosa, la base estructural de las plantas. Los animales pueden sintetizar una variedad de carbohidratos a partir de grasas y proteínas, pero la mayoría de los carbohidratos provienen de alimentos vegetales.
