Autorradiografía. Radioautografía Método de autorradiografía en citología
Autorradiografía autorradiografía, radioautografía, un método para estudiar la distribución de sustancias radiactivas en un objeto bajo estudio imponiendo una emulsión fotográfica sensible a la radiación radiactiva en el objeto. Las sustancias radiactivas contenidas en el objeto parecen fotografiarse a sí mismas (de ahí el nombre). El método A. se usa ampliamente en física y tecnología, en biología y medicina, en todas partes donde se usan trazadores de isótopos. Tras revelar y fijar la emulsión fotográfica, se obtiene sobre ella una imagen que muestra la distribución objeto de estudio. Hay varias formas de aplicar emulsión fotográfica a un objeto. Se puede aplicar directamente una placa fotográfica a la superficie pulida de la muestra, o se puede aplicar una emulsión líquida tibia a la muestra, que, cuando se solidifica, forma una capa estrechamente adyacente a la muestra y se examina después de la exposición y el fotoprocesamiento. La distribución de sustancias radiactivas se estudia comparando la densidad de ennegrecimiento de la película de la muestra de prueba y de referencia (la llamada macrorradiografía). El segundo método consiste en contar las trazas formadas por partículas ionizantes en una emulsión fotográfica utilizando un microscopio óptico o electrónico (microrradiografía). Este método es mucho más sensible que el primero. Para la obtención de macroautografías se utilizan emulsiones de transparencias y de rayos X, y para microautografías se utilizan emulsiones especiales de grano fino. Una imagen fotográfica de la distribución de sustancias radiactivas en el objeto en estudio, obtenida por el método A., se denomina autorradiograma o radioautografía. Sobre el arroz. 12
y 3
se dan ejemplos de autorradiogramas. El método A. puede detectar la presencia de elementos radiactivos en varios minerales, la distribución de elementos radiactivos naturales en los tejidos de organismos animales y vegetales, etc. La introducción de compuestos marcados con radioisótopos en el cuerpo y el examen posterior de tejidos y células por el método de A. hace posible obtener datos precisos sobre las células o estructuras celulares particulares en las que ocurren ciertos procesos, se localizan ciertas sustancias y para establecer los parámetros de tiempo de una serie de procesos. Entonces, por ejemplo, el uso de fósforo radiactivo y A. hizo posible detectar la presencia de un metabolismo intensivo en un hueso en crecimiento; el uso de yodo radiactivo y A. permitió aclarar los patrones de actividad de la glándula tiroides; la introducción de compuestos marcados, precursores de proteínas y ácidos nucleicos, y A. ayudaron a comprender el papel de ciertas estructuras celulares en el intercambio de estos compuestos vitales. El método A. permite determinar no solo la localización de un radioisótopo en un objeto biológico, sino también su cantidad, ya que el número de granos reducidos de plata en la emulsión es proporcional al número de partículas que actúan sobre él. El análisis cuantitativo de macroautografías se realiza por los métodos habituales de fotometría (Ver Fotometría) ,
y microautógrafos - contando bajo un microscopio granos de plata o huellas-huellas que han surgido en la emulsión bajo la acción de partículas ionizantes. A. comenzar a combinarse con éxito con la microscopía electrónica (ver Microscopía electrónica). Véase también Radiografía. Iluminado.: Boyd D. A. Autorradiografía en biología y medicina, trad. del inglés, M., 1957; Zhinkin L. N., The use of radiactive isotopes in histology, en el libro: Radiotracers in histology, L., 1959, p. 5-33; Perry R., Autorradiografía cuantitativa, Methods in Cell Physiology, 1964, v. yo, cap. 15, pág. 305-26. N. G. Kruschov. Arroz. 2. Autorradiograma (impresión) que muestra la distribución de fósforo (32 P) en hojas de tomate. La planta se colocó previamente en una solución que contenía fósforo radiactivo. Las áreas claras corresponden a concentraciones elevadas del isótopo radiactivo; se puede observar que el fósforo se concentra en el tallo y en las partes vasculares de las hojas. Arroz. 1. Microradiograma de una muestra de níquel. Se estudia la difusión del estaño marcado con el isótopo radiactivo 113 Sn en el níquel. La distribución del estaño radiactivo muestra que la difusión ocurre principalmente a lo largo de los límites de grano del níquel.
Gran enciclopedia soviética. - M.: Enciclopedia soviética. 1969-1978 .
Sinónimos:Vea qué es "Autorradiografía" en otros diccionarios:
- (de auto ... y radiografía) un método para registrar la distribución de sustancias radiactivas en un objeto. Se aplica una película con una emulsión sensible a la radiación a la superficie (corte). Las sustancias radiactivas, por así decirlo, toman fotografías de sí mismas ... ... Gran diccionario enciclopédico
- (radioautografía), un método para medir la distribución de radioact. c c en el objeto de estudio (según su propia radiación), consistente en aplicar sobre él una capa de emulsión fotográfica nuclear. La distribución está determinada por la densidad del ennegrecimiento desarrollado... ... Enciclopedia Física
Un método para estudiar la distribución de sustancias radiactivas (isótopos) en un objeto o compuestos bajo estudio. Consiste en imponer sobre un objeto (o, por ejemplo, un cromatograma) una emulsión fotográfica sensible a la radiación radiactiva y obtener una impresión, ... ... diccionario de microbiologia
Exist., número de sinónimos: 4 autorradiografía (2) macroautoradiografía (1) ... Diccionario de sinónimos
Autorradiografía. Véase radioautografía. (Fuente: "Diccionario explicativo inglés ruso de términos genéticos". Arefiev V.A., Lisovenko L.A., Moscú: VNIRO Publishing House, 1995) ... Biología molecular y genética. Diccionario.
autorradiografía- Método para el estudio de la distribución de radiactivos. componentes en la muestra en estudio por su propia radiación imponiendo sobre la muestra sensible al acto radiactivo. radiación de emulsión. La distribución está determinada por la densidad del ennegrecimiento desarrollado... ... Manual del traductor técnico
Autorradiografía- * autorradiografía * autorradiografía ver ... Genética. diccionario enciclopédico
- (de auto ... y radiografía), un método para registrar la distribución de sustancias radiactivas en un objeto. Se aplica una película con una emulsión sensible a la radiación a la superficie (corte). Las sustancias radiactivas, por así decirlo, toman fotografías de sí mismas ... ... diccionario enciclopédico
Libros
- Autorradiografía en Biología y Medicina, J. Boyd, El libro pertenece a uno de los creadores del método de autorradiografía. Los primeros ocho capítulos están dedicados a la teoría de la pregunta. Consideran la teoría del proceso fotográfico, propiedades y características... Categoría: Fundamentos del conocimiento médico Editor:
La radioautografía es un método relativamente nuevo que ha ampliado enormemente las posibilidades de la microscopía óptica y electrónica. Este es un método muy moderno, debido al desarrollo de la física nuclear, que permitió obtener isótopos radiactivos de varios elementos. Para radioautografía, en particular, isótopos de aquellos elementos que son utilizados por la célula o pueden unirse a sustancias utilizadas por la célula, y que pueden administrarse a animales o agregarse a cultivos en cantidades que no interfieren con el metabolismo celular normal. Dado que un isótopo radiactivo (o una sustancia marcada con él) participa en reacciones bioquímicas de la misma manera que su contraparte no radiactiva y al mismo tiempo emite radiación, la trayectoria de los isótopos en el cuerpo se puede rastrear usando varios métodos para detectar radioactividad. Una forma de detectar la radiactividad se basa en su capacidad para actuar sobre una película fotográfica como la luz; pero la radiación radiactiva penetra el papel negro utilizado para proteger la película de la luz y tiene el mismo efecto sobre la película que la luz.
Para poder detectar la radiación emitida por los isótopos radiactivos en las preparaciones destinadas al estudio con microscopios ópticos o electrónicos, las preparaciones se cubren en una habitación oscura con una emulsión fotográfica especial, después de lo cual se dejan durante algún tiempo en la oscuridad. Luego se revelan las diapositivas (también en la oscuridad) y se fijan. Las áreas de la droga que contienen isótopos radiactivos afectan la emulsión que se encuentra sobre ellas, en la que aparecen "granos" oscuros bajo la acción de la radiación emitida. Así, reciben autógrafos radiofónicos (del griego. radio- radiante autos- yo y grafo- escribe).
Al principio, los histólogos tenían solo unos pocos isótopos radiactivos; por ejemplo, muchos de los primeros estudios que utilizaron autorradiografía utilizaron fósforo radiactivo. Posteriormente se utilizaron muchos más de estos isótopos; El isótopo radiactivo del hidrógeno, el tritio, ha encontrado un uso particularmente generalizado.
La autorradiografía ha sido y sigue siendo muy utilizada para estudiar dónde y cómo ocurren ciertas reacciones bioquímicas en el cuerpo.
Los compuestos químicos marcados con isótopos radiactivos que se utilizan para estudiar procesos biológicos se denominan precursores. Los precursores suelen ser sustancias similares a las que el organismo recibe de los alimentos; sirven como bloques de construcción para construir tejidos y se incorporan a los componentes complejos de células y tejidos de la misma manera que se incorporan a ellos los bloques de construcción no marcados. El componente tisular en el que se incorpora el precursor marcado y que emite radiación se denomina producto.
Las células cultivadas en cultivo, aunque sean del mismo tipo, estarán en diferentes etapas del ciclo celular en un momento dado, a menos que se tenga un cuidado especial para sincronizar sus ciclos. Sin embargo, al inyectar tritio-timidina en las células y luego hacer autógrafos, es posible determinar la duración de las distintas etapas del ciclo. El tiempo de inicio de una etapa, la mitosis, se puede determinar sin timidina marcada. Para ello, una muestra de células del cultivo se mantiene bajo observación en un microscopio de contraste de fase, lo que permite seguir directamente el curso de la mitosis y establecer su tiempo. La duración de la mitosis suele ser de 1 hora, aunque en algunos tipos de células se tarda hasta 1,5 horas.
método de autografía por radio
Autografía radiofónica, definición, historia.
El método de autorradiografía se basa en la introducción de un compuesto "marcado" con un átomo radiactivo en el objeto de estudio y la identificación del lugar de su inclusión mediante el registro fotográfico de la radiación. La base para obtener una imagen es el efecto de las partículas ionizantes formadas durante la desintegración de un átomo radiactivo en una emulsión fotográfica nuclear que contiene cristales de haluro de plata.
El descubrimiento del método de autorradiografía está directamente relacionado con el descubrimiento del fenómeno de la radiactividad. En 1867 se publicó la primera observación sobre el efecto de las sales de uranio en los haluros de plata (Niepce de St.Victor). En 1896, Henry Becquerel observó la iluminación de una placa fotográfica con sales de uranio sin exposición previa a la luz. Este experimento se considera el momento del descubrimiento del fenómeno de la radiactividad. La autorradiografía aplicada a material biológico fue utilizada por primera vez por Lacassagne y Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) en la década de 1920; el bloque histológico de varios órganos de animales después de la introducción de isótopos se presionó con su lado plano contra la placa de rayos X y se expuso. Se preparó previamente una sección histológica y se sometió a un procedimiento de tinción estándar. El autógrafo resultante se estudió por separado del corte. Este método permite estimar la intensidad de incorporación de isótopos en una muestra biológica. En la década de 1940, Leblond utilizó la autorradiografía para demostrar la distribución del isótopo de yodo en secciones de la glándula tiroides (Leblond C.P. 1943).
Los primeros intentos de combinar autorradiografía con microscopía electrónica se realizaron en la década de 1950 (Liquir-Milward, 1956). La autorradiografía con microscopio electrónico es un caso especial de la autorradiografía convencional, en la que también se cuentan los granos de plata y se tiene en cuenta su distribución. La peculiaridad del método es el uso de una capa muy delgada de emulsión. En la actualidad se ha conseguido una resolución de unos 50 nm, que es 10-20 veces mayor que con microscopía óptica.
En la actualidad, el método de autorradiografía se ha complementado con la posibilidad de estimar automáticamente el número de granos de plata mediante analizadores de vídeo. A menudo, para amplificar la señal de la etiqueta (por regla general, estos son isótopos de alta energía), se utilizan varios tipos de centelleadores, depositados en placas (pantalla intensificadora recubierta de fósforo) o impregnados en una emulsión (PPO), en este caso , la emisión de fotones ilumina una placa o película fotográfica convencional.
Principio fotográfico de obtención de una imagen, emulsión fotográfica.
En un estudio radiográfico, el papel de un detector de desintegración nuclear lo realiza una emulsión fotográfica, en la que, cuando pasa una partícula ionizante, queda una imagen latente, que luego se revela durante el revelado, de manera similar al procesamiento de una película fotográfica ordinaria.
La fotoemulsión es una suspensión de microcristales de haluro de plata en gelatina. Los microcristales tienen defectos estructurales llamados centros de sensibilidad. Según el modelo de Gurney-Mott, estas perturbaciones en la red iónica de un cristal son capaces de capturar los electrones que se liberan cuando una partícula alfa o beta pasa por la banda de conducción del cristal, por lo que el ion se convierte en un átomo. . La imagen latente resultante puede revelarse mediante un procedimiento que convierte los cristales de haluro de plata activados en granos de plata metálica (este proceso se denomina revelado químico). Cualquier agente con suficiente actividad reductora puede usarse como revelador (típicamente se usan metol, amidol o hidroquinona en fotografía y autorradiografía). Después de la exposición de los cristales expuestos, los microcristales de haluro de plata restantes se eliminan de la emulsión con un fijador (generalmente hiposulfito). Las emulsiones fotográficas nucleares se caracterizan por su resolución (grano) y sensibilidad. El primero está determinado por el tamaño de los microcristales de sal de plata y es inversamente proporcional al segundo. La emulsión fotográfica se caracteriza por una sensibilidad reducida a la luz visible, pero el trabajo con ella, sin embargo, debe hacerse en la oscuridad para excluir la aparición de artefactos.
La emulsión se puede aplicar al fármaco en forma de una película acabada con un sustrato o sumergiendo el fármaco en una emulsión líquida calentada; de esta forma se obtiene una capa fina y uniforme, que se desarrolla de la forma habitual. Antes de aplicar la emulsión para microscopía óptica, el portaobjetos suele teñirse con el tinte histológico deseado, pero más pálido de lo habitual, para permitir el recuento de granos de plata en todas las áreas. El fármaco se expone durante un tiempo determinado, luego se desarrolla.
Isótopos utilizados en autorradiografía.
En autorradiografía, dependiendo de los objetivos del estudio y los materiales disponibles, se pueden utilizar varios isótopos. La imagen creada por una partícula ionizante en una emulsión fotográfica nuclear depende de la energía de la partícula y del tipo de su interacción con la materia.
Las partículas alfa emitidas por núcleos radiactivos idénticos tienen la misma energía ( mi) y la misma longitud de camino ( R) , conectado por la siguiente relación:
R = kE3/2
Dónde k – una constante que caracteriza el medio en el que se propagan las partículas. El rango de partículas en el corazón está determinado por su densidad y composición elemental. La relación de Bragg-Klymen permite estimar el rango en una sustancia con masa atómica A y densidad por el rango de las partículas alfa en el aire (R0) d:
R= 0.0003 (R0 / d) A1/2
Dado que el poder ionizante de las partículas alfa es muy alto, esto facilita el registro fotográfico de la distribución de isótopos y también permite el uso de materiales que no sean emulsiones para el registro. El rastro de partículas alfa emitidas por una fuente, en autógrafos, parece un haz de segmentos rectos, generalmente de 15 a 50 micrones de largo, que emanan de un punto, lo que le permite localizar con precisión el sitio de inclusión de una etiqueta radiactiva. Sin embargo, las partículas alfa son emitidas por isótopos con números atómicos grandes, lo que limita su uso como marca biológica.
Las huellas de partículas alfa a menudo se observan en radiografías histológicas como un artefacto, el resultado de la auto-radiación de isótopos en el portaobjetos de vidrio.
La radiación beta se caracteriza por un espectro continuo de la energía inicial de las partículas, desde cero hasta E max determinado para cada isótopo. Las formas del espectro difieren significativamente. Por lo tanto, la energía más probable de las partículas emitidas por el tritem es 1/7 de E max, 14C - alrededor de ¼, 32P - alrededor de 1/3. La energía máxima de la radiación beta de varios isótopos varía de 18 keV a 3,5 MeV, en un rango mucho más amplio que la radiación alfa. Como regla general, la energía máxima es mayor para los isótopos de vida corta.
El paso de partículas beta y electrones monoenergéticos a través de la materia va acompañado de dos tipos principales de interacción. Al interactuar con un electrón en órbita, la partícula puede transferirle energía suficiente para ionizar el átomo (retirar el electrón de la órbita). En casos raros, esta energía es tan alta que se puede observar la trayectoria del electrón liberado. Debido a la igualdad de las masas de la partícula y el electrón, existe una desviación del movimiento inicial. La interacción del segundo tipo, con núcleos atómicos, conduce a la aparición de rayos X de bremsstrahlung. Aunque este último no es registrado por la emulsión, el acto de interacción de la partícula con el núcleo puede ser detectado por una ruptura brusca en la trayectoria.
La interacción repetida con los electrones en órbita conduce a una curvatura de la trayectoria, que suele tener el aspecto de una línea sinuosa, especialmente en la parte final, cuando la velocidad de la partícula disminuye y el poder ionizante aumenta. La longitud de la trayectoria excede notablemente la distancia desde el punto inicial hasta el final de la pista: la carrera. Por esta razón, incluso los electrones monoenergéticos se caracterizan por la presencia de un rango de rangos limitado desde arriba por R max, que es típico para esta radiación. Debido a las menores pérdidas por ionización, las partículas beta son más difíciles de detectar que las partículas alfa. No forman pistas continuas (a excepción de la radiación más suave de tritio; sin embargo, en este caso, la probabilidad de pasar a través de más de un cristal de emulsión es pequeña), la densidad y el número de cristales desarrollados varían dentro de diferentes límites. El rango de una partícula beta en otro elemento se puede estimar a partir de la fórmula:
R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)
En un amplio rango de valores de E máximo el kilometraje máximo está relacionado con la energía máxima por la relación:
R metro= 412 mi máximo 1.265 – 0.0954 lnE máximo
La diferencia en los rangos, la capacidad de ionización y la densidad de los cristales de emulsión desarrollados para partículas con diferentes energías se puede utilizar para discriminar la distribución de elementos si sus isótopos difieren significativamente en E max, como en el caso del tritio y el 14C. La discriminación de la distribución de dos isótopos se lleva a cabo aplicando dos capas de emulsión a la muestra, la primera capa registra una radiación predominantemente suave, la segunda, dura. Según algunos trabajos, diferentes isótopos pueden separarse de manera confiable del tamaño de los cristales de emulsión desarrollados: los cristales afectados por la partícula beta de tritio, que tiene un mayor poder de ionización, son más grandes.
Los electrones de conversión interna se forman cuando se absorbe un cuanto gamma con una energía de radiación muy baja y se extrae un electrón de la capa interna de un átomo. Estos electrones son similares a las partículas beta blandas, pero a diferencia de estas últimas, son monoenergéticos. La presencia de electrones de conversión internos permite el uso de isótopos como el 125I.
En la actualidad, los isótopos emisores de partículas beta más utilizados. Por regla general, el tritio se utiliza para el marcaje en estudios histológicos. Los primeros autógrafos con tritio se hicieron en la década de 1950 (Fitzgerald et al. 1951), pero su uso generalizado comenzó después de que se obtuviera timidina marcada con tritio en el Laboratorio Brookhaven. Dado que el hidrógeno forma parte de todas las sustancias orgánicas, al utilizar tritio se pueden obtener una variedad de compuestos que llevan una etiqueta radiactiva. Cuanto menor es la energía de la partícula emitida, más corta es la huella que deja cuando se mueve en una emulsión fotográfica, y con mayor precisión es posible localizar la ubicación del átomo marcado. La longitud de la trayectoria de las partículas de tritio beta es de aproximadamente 1-2 μm, la energía más probable es de 0,005 MeV y la trayectoria consiste en la mayoría de los casos en un solo grano de plata, lo que permite localizar la fuente de radiación no solo en células relativamente grandes. estructuras, como el núcleo, sino también en cromosomas individuales.
La introducción de metabolitos "marcados" en el cuerpo permite rastrear la incorporación del isótopo en las células de los tejidos animales, lo que permite estudiar una variedad de procesos bioquímicos en un organismo vivo.
Obtener datos absolutos: la concentración de la sustancia marcada en el objeto de estudio rara vez es el objetivo de la investigación radioautográfica, para esto es necesario conocer una serie de condiciones, cuya determinación es difícil. Por lo tanto, los estudios radioautográficos cuantitativos generalmente se llevan a cabo comparando la concentración de granos de plata sobre el objeto de prueba y el control, mientras que los datos de control se toman convenientemente como uno o 100%.
Características de algunos isótopos utilizados
en radioautografía de objetos biológicos
método de autografía por radio
Autografía radiofónica, definición, historia.
El método de autorradiografía se basa en la introducción de un compuesto "marcado" con un átomo radiactivo en el objeto de estudio y la identificación del lugar de su inclusión mediante el registro fotográfico de la radiación. La base para obtener una imagen es el efecto de las partículas ionizantes formadas durante la desintegración de un átomo radiactivo en una emulsión fotográfica nuclear que contiene cristales de haluro de plata.
El descubrimiento del método de autorradiografía está directamente relacionado con el descubrimiento del fenómeno de la radiactividad. En 1867 se publicó la primera observación sobre el efecto de las sales de uranio en los haluros de plata (Niepce de St.Victor). En 1896, Henry Becquerel observó la iluminación de una placa fotográfica con sales de uranio sin exposición previa a la luz. Este experimento se considera el momento del descubrimiento del fenómeno de la radiactividad. La autorradiografía aplicada a material biológico fue utilizada por primera vez por Lacassagne y Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) en la década de 1920; el bloque histológico de varios órganos de animales después de la introducción de isótopos se presionó con su lado plano contra la placa de rayos X y se expuso. Se preparó previamente una sección histológica y se sometió a un procedimiento de tinción estándar. El autógrafo resultante se estudió por separado del corte. Este método permite estimar la intensidad de incorporación de isótopos en una muestra biológica. En la década de 1940, Leblond utilizó la autorradiografía para demostrar la distribución del isótopo de yodo en secciones de la glándula tiroides (Leblond C.P. 1943).
Los primeros intentos de combinar autorradiografía con microscopía electrónica se realizaron en la década de 1950 (Liquir-Milward, 1956). La autorradiografía con microscopio electrónico es un caso especial de la autorradiografía convencional, en la que también se cuentan los granos de plata y se tiene en cuenta su distribución. La peculiaridad del método es el uso de una capa muy delgada de emulsión. En la actualidad se ha conseguido una resolución de unos 50 nm, que es 10-20 veces mayor que con microscopía óptica.
En la actualidad, el método de autorradiografía se ha complementado con la posibilidad de estimar automáticamente el número de granos de plata mediante analizadores de vídeo. A menudo, para amplificar la señal de la etiqueta (por regla general, estos son isótopos de alta energía), se utilizan varios tipos de centelleadores, depositados en placas (pantalla intensificadora recubierta de fósforo) o impregnados en una emulsión (PPO), en este caso , la emisión de fotones ilumina una placa o película fotográfica convencional.
Principio fotográfico de obtención de una imagen, emulsión fotográfica.
En un estudio radiográfico, el papel de un detector de desintegración nuclear lo realiza una emulsión fotográfica, en la que, cuando pasa una partícula ionizante, queda una imagen latente, que luego se revela durante el revelado, de manera similar al procesamiento de una película fotográfica ordinaria.
La fotoemulsión es una suspensión de microcristales de haluro de plata en gelatina. Los microcristales tienen defectos estructurales llamados centros de sensibilidad. Según el modelo de Gurney-Mott, estas perturbaciones en la red iónica de un cristal son capaces de capturar los electrones que se liberan cuando una partícula alfa o beta pasa por la banda de conducción del cristal, por lo que el ion se convierte en un átomo. . La imagen latente resultante puede revelarse mediante un procedimiento que convierte los cristales de haluro de plata activados en granos de plata metálica (este proceso se denomina revelado químico). Cualquier agente con suficiente actividad reductora puede usarse como revelador (típicamente se usan metol, amidol o hidroquinona en fotografía y autorradiografía). Después de la exposición de los cristales expuestos, los microcristales de haluro de plata restantes se eliminan de la emulsión con un fijador (generalmente hiposulfito). Las emulsiones fotográficas nucleares se caracterizan por su resolución (grano) y sensibilidad. El primero está determinado por el tamaño de los microcristales de sal de plata y es inversamente proporcional al segundo. La emulsión fotográfica se caracteriza por una sensibilidad reducida a la luz visible, pero el trabajo con ella, sin embargo, debe hacerse en la oscuridad para excluir la aparición de artefactos.
La emulsión se puede aplicar al fármaco en forma de una película acabada con un sustrato o sumergiendo el fármaco en una emulsión líquida calentada; de esta forma se obtiene una capa fina y uniforme, que se desarrolla de la forma habitual. Antes de aplicar la emulsión para microscopía óptica, el portaobjetos suele teñirse con el tinte histológico deseado, pero más pálido de lo habitual, para permitir el recuento de granos de plata en todas las áreas. El fármaco se expone durante un tiempo determinado, luego se desarrolla.
Isótopos utilizados en autorradiografía.
En autorradiografía, dependiendo de los objetivos del estudio y los materiales disponibles, se pueden utilizar varios isótopos. La imagen creada por una partícula ionizante en una emulsión fotográfica nuclear depende de la energía de la partícula y del tipo de su interacción con la materia.
Las partículas alfa emitidas por núcleos radiactivos idénticos tienen la misma energía ( mi) y la misma longitud de camino ( R) , conectado por la siguiente relación:
R = kE 3/2
Dónde k – una constante que caracteriza el medio en el que se propagan las partículas. El rango de partículas en el corazón está determinado por su densidad y composición elemental. La relación de Bragg-Klymen permite, por el rango de partículas alfa en el aire (R 0), estimar el rango en una sustancia con masa atómica A y densidad d:
R= 0.0003 (R0 / d) Un 1/2
Dado que el poder ionizante de las partículas alfa es muy alto, esto facilita el registro fotográfico de la distribución de isótopos y también permite el uso de materiales que no sean emulsiones para el registro. El rastro de partículas alfa emitidas por una fuente, en autógrafos, parece un haz de segmentos rectos, generalmente de 15 a 50 micrones de largo, que emanan de un punto, lo que le permite localizar con precisión el sitio de inclusión de una etiqueta radiactiva. Sin embargo, las partículas alfa son emitidas por isótopos con números atómicos grandes, lo que limita su uso como marca biológica.
Las huellas de partículas alfa a menudo se observan en radiografías histológicas como un artefacto, el resultado de la auto-radiación de isótopos en el portaobjetos de vidrio.
El paso de partículas beta y electrones monoenergéticos a través de la materia va acompañado de dos tipos principales de interacción. Al interactuar con un electrón en órbita, la partícula puede transferirle energía suficiente para ionizar el átomo (retirar el electrón de la órbita). En casos raros, esta energía es tan alta que se puede observar la trayectoria del electrón liberado. Debido a la igualdad de las masas de la partícula y el electrón, existe una desviación del movimiento inicial. La interacción del segundo tipo, con núcleos atómicos, conduce a la aparición de rayos X de bremsstrahlung. Aunque este último no es registrado por la emulsión, el acto de interacción de la partícula con el núcleo puede ser detectado por una ruptura brusca en la trayectoria.
La interacción repetida con los electrones en órbita conduce a una curvatura de la trayectoria, que suele tener el aspecto de una línea sinuosa, especialmente en la parte final, cuando la velocidad de la partícula disminuye y el poder ionizante aumenta. La longitud de la trayectoria excede notablemente la distancia desde el punto inicial hasta el final de la pista: la carrera. Por esta razón, incluso los electrones monoenergéticos se caracterizan por la presencia de un rango de rangos limitado desde arriba por R max, que es típico para esta radiación. Debido a las menores pérdidas por ionización, las partículas beta son más difíciles de detectar que las partículas alfa. No forman pistas continuas (a excepción de la radiación más suave de tritio; sin embargo, en este caso, la probabilidad de pasar a través de más de un cristal de emulsión es pequeña), la densidad y el número de cristales desarrollados varían dentro de diferentes límites. El rango de una partícula beta en otro elemento se puede estimar a partir de la fórmula:
R = R A1 (Z/A) A1 / (Z/A)
En un amplio rango de valores de E máximo el kilometraje máximo está relacionado con la energía máxima por la relación:
R metro= 412 mi máximo 1.265 – 0.0954 lnE máximo
La diferencia en los rangos, la capacidad de ionización y la densidad de los cristales de emulsión desarrollados para partículas con diferentes energías se puede utilizar para discriminar la distribución de elementos si sus isótopos difieren significativamente en E max, como en el caso del tritio y el 14 C. Discriminación de la distribución de dos isótopos se lleva a cabo mediante la aplicación sobre una muestra de dos capas de emulsión, la primera capa registra una radiación predominantemente suave, la segunda, dura. Según algunos trabajos, diferentes isótopos pueden separarse de manera confiable del tamaño de los cristales de emulsión desarrollados: los cristales afectados por la partícula beta de tritio, que tiene un mayor poder de ionización, son más grandes.
Los electrones de conversión interna se forman cuando se absorbe un cuanto gamma con una energía de radiación muy baja y se extrae un electrón de la capa interna de un átomo. Estos electrones son similares a las partículas beta blandas, pero a diferencia de estas últimas, son monoenergéticos. La presencia de electrones de conversión internos permite el uso de isótopos como el 125I.
En la actualidad, los isótopos emisores de partículas beta más utilizados. Por regla general, el tritio se utiliza para el marcaje en estudios histológicos. Los primeros autógrafos con tritio se hicieron en la década de 1950 (Fitzgerald et al. 1951), pero su uso generalizado comenzó después de que se obtuviera timidina marcada con tritio en el Laboratorio Brookhaven. Dado que el hidrógeno forma parte de todas las sustancias orgánicas, al utilizar tritio se pueden obtener una variedad de compuestos que llevan una etiqueta radiactiva. Cuanto menor es la energía de la partícula emitida, más corta es la huella que deja cuando se mueve en una emulsión fotográfica, y con mayor precisión es posible localizar la ubicación del átomo marcado. La longitud de la trayectoria de las partículas de tritio beta es de aproximadamente 1-2 μm, la energía más probable es de 0,005 MeV y la trayectoria consiste en la mayoría de los casos en un solo grano de plata, lo que permite localizar la fuente de radiación no solo en células relativamente grandes. estructuras, como el núcleo, sino también en cromosomas individuales.
La introducción de metabolitos "marcados" en el cuerpo permite rastrear la incorporación del isótopo en las células de los tejidos animales, lo que permite estudiar una variedad de procesos bioquímicos en un organismo vivo.
Obtener datos absolutos: la concentración de la sustancia marcada en el objeto de estudio rara vez es el objetivo de la investigación radioautográfica, para esto es necesario conocer una serie de condiciones, cuya determinación es difícil. Por lo tanto, los estudios radioautográficos cuantitativos generalmente se llevan a cabo comparando la concentración de granos de plata sobre el objeto de prueba y el control, mientras que los datos de control se toman convenientemente como uno o 100%.
Características de algunos isótopos utilizados
en radioautografía de objetos biológicos
Las partículas beta de fósforo radiactivo son capaces de volar distancias de hasta varios milímetros en una emulsión nuclear, la pista consta de docenas de partículas de plata raramente ubicadas; por ejemplo, el fósforo radiactivo solo se puede usar para estudiar la distribución del isótopo en los tejidos. , no se puede establecer la localización en estructuras celulares individuales.
El azufre y el carbono radiactivos se pueden utilizar para localizar el isótopo en células individuales, siempre que sean grandes o estén suficientemente separados, lo que se puede lograr en frotis de sangre o suspensiones celulares.
Resolución y errores de método, errores de método.
error geométrico– debido al hecho de que la partícula emitida puede dirigirse en cualquier ángulo a la superficie de la fotocapa. En consecuencia, el grano de plata en la fotocapa puede no estar ubicado exactamente sobre el átomo radiactivo, sino más o menos desplazado según la dirección del movimiento de la partícula y la longitud del camino (energía).
error de foto surge debido al hecho de que un grano de plata, que consta de miles de átomos de metal, es mucho más grande que un átomo radiactivo. Por lo tanto, la localización de un objeto más pequeño debe juzgarse en función de la posición del más grande.
Cuando se utiliza tritio, que se caracteriza por la baja energía (kilometraje) de las partículas emitidas y las emulsiones fotográficas nucleares con un tamaño de grano bajo, la resolución del método de autorradiografía se encuentra dentro de la resolución de los sistemas ópticos: 1 μm. Por lo tanto, estos errores no tienen un impacto significativo en el resultado.
Para lograr una mejor resolución, es necesario reducir el espesor del corte, la capa de emulsión y la distancia entre ellos. La muestra debe estar ligeramente subexpuesta.
Efecto de autoabsorción: La cantidad de granos de plata depende del grado de absorción de la radiación por parte de las estructuras celulares, debido al bajo rango y la baja energía de las partículas beta, su absorción en los tejidos es bastante grande, lo que puede conducir a la pérdida de la marca, por lo que la cuestión de el espesor de las secciones cobra importancia. Se ha demostrado que el número de granos de plata es proporcional a la radiactividad tisular solo en un espesor de corte de no más de 5 micras.
El número relativo de partículas beta que han pasado a través de la capa absorbente con un espesor X se puede estimar de acuerdo con la ley de Baer:
norte X/NORTE 0 = mi - m X
Donde m es el coeficiente de absorción (el recíproco del espesor de la capa, durante cuyo paso el número de partículas disminuye en mi una vez. El valor del coeficiente de absorción se puede estimar aproximadamente a partir del valor de R metro(rango máximo), conocido para todos los isótopos, usando la relación m R metro= 10, que es válido para radiación no demasiado fuerte.
Si en una capa de unidad de espesor por unidad de tiempo hay n partículas moviéndose hacia la superficie, entonces en una muestra con un espesor X superficie alcanzará N partículas:
Antecedentes y artefactos: Las influencias mecánicas también pueden introducir un error en las mediciones: arañazos, grietas en la emulsión que conducen a la formación de una imagen latente y radiación de fondo, que deben tenerse en cuenta al procesar autógrafos. El fondo se tiene en cuenta contando la cantidad de granos de plata en el área vacía de la preparación. También se introducen errores como resultado del procesamiento histológico de las secciones: cableado para alcoholes (deshidratación), inclusión de parafina, tinción. Estos procedimientos pueden afectar el tamaño y la proporción de las estructuras celulares.
Efecto de la radiación de los metabolitos marcados: Debido a la baja energía de radiación, el tritio provoca una ionización significativa en la célula, mucho mayor que el efecto radiativo de las partículas beta de carbono. Como resultado, con la acción prolongada de un compuesto marcado, por ejemplo, 3H-timidina, las células se destruyen y mueren, lo que lleva a la detención del crecimiento del tejido. En primer lugar, se altera la espermatogénesis. Hay evidencia de efectos mutagénicos y cancerígenos de los metabolitos marcados. Los cambios citológicos observados consisten en la interrupción del paso del ciclo mitótico por las células, cambios en la ploidía celular y la aparición de aberraciones cromosómicas. Pero, aparentemente, el efecto dañino del isótopo en las células puede afectar notablemente los resultados del estudio solo en las condiciones de un experimento prolongado.
Cuantificación de radiactividad
Como regla general, en el experimento no se determina la cantidad absoluta, sino la relativa del isótopo incluido. El grado de inclusión de la etiqueta se puede evaluar de dos maneras, densitométricamente, que es más aplicable a macroautografías y conteo directo de granos de plata sobre objetos. Actualmente, este procedimiento que lleva mucho tiempo se puede realizar usando una computadora. Una imagen digital de una preparación histológica es procesada por un software especial para resaltar automáticamente las células y estructuras celulares en ella y contar la cantidad de granos de plata. Si surge la cuestión de la evaluación cuantitativa, es necesario involucrar el concepto de eficiencia. Muy a menudo, la eficiencia se entiende como el número de granos de plata formados durante el registro de una desintegración radiactiva. La efectividad del método está influenciada por muchos factores, principalmente el grosor del objeto y la emulsión.
En estudios que utilizaron un contador de centelleo, se encontró una alta correlación entre el número promedio de desintegraciones por minuto y el número de granos de plata. Según Hunt (Hunt y Foote, 1967), la formación de un grano en la emulsión utilizada en el experimento corresponde a 5,8 decaimientos radiactivos, es decir, la eficiencia del método es del 17,8%.
Para cuantificar el tritio en preparaciones macroscópicas se pueden utilizar muestras con actividad estándar, que se montan sobre el mismo autógrafo.
Una evaluación precisa de la radiactividad de los objetos biológicos comparados es muy difícil.
Un ejemplo clásico de un estudio radioautográfico es el trabajo sobre la acumulación de 32 P en el ADN de las células de la raíz de haba (Howard y Pelc, 1953). En este experimento, la división del ciclo mitótico en cuatro períodos (mitosis - M, G 1 - período presintético, S - síntesis de ADN, período premitótico G 2) demostró por primera vez que el período de síntesis de ADN ocupa un tiempo limitado. parte de la interfase, estando separados en el tiempo desde el inicio y el final de la mitosis. Los datos de Howard y Pelk se confirmaron más tarde en experimentos más precisos utilizando un precursor de ADN específico, la 3H-timidina.
Métodos para evaluar la síntesis de proteínas. Los precursores más comunes para evaluar la síntesis de proteínas totales en estudios radioautográficos son 3H-leucina, 3H-metionina, 3H-fenilalanina. Por ejemplo, se estudió la síntesis de proteína total en el cerebro de ratas durante las primeras semanas de desarrollo posnatal utilizando un marcador de leucina (Pavlik y Jakoubek, 1976). Para estudiar la síntesis de histonas y su efecto sobre la regulación de la transcripción se utilizan los aminoácidos básicos 3H-lisina y 3H-arginina, y el 3H-triptófano se utiliza para estudiar la síntesis de proteínas ácidas. La densidad de inclusión de la etiqueta de aminoácidos corresponde a la intensidad de la síntesis de proteínas y, por lo tanto, refleja la actividad funcional de la neurona. El método radioautográfico permite comparar las características de la síntesis de proteínas en varios tejidos animales bajo exposición experimental y nos permite rastrear la dinámica de los cambios a nivel de tipos de células individuales y estructuras celulares (núcleo, cuerpo celular, procesos neuronales - axonal transporte).
Actualmente, la autorradiografía se usa a menudo para estudiar el cerebro en estudios que usan radioligandos para ciertos receptores. Así, se construyeron mapas de la distribución de varios receptores en las estructuras cerebrales de animales y humanos.
La autorradiografía también se utiliza para visualizar geles en bioquímica y en combinación con inmunoensayos (RIA).
Referencias:
1. Epifanova O. I. et al Radio autógrafo M., Higher School, 1977
2. Sarkisov D.S. Perov Yu.L. Técnica microscópica M.: "Medicina", 1996
3.Rogers A.W. Autorradiografía práctica, Amersham Reino Unido, 1982
4.Bokshtein S.Z. SS de Ginzburg et al.. Autorradiografía microscópica electrónica en la ciencia de los metales M., "Metallurgy"
autorradiograma a fiya, autorradiografía, autorradiografía , un método para estudiar la distribución de sustancias radiactivas en un objeto bajo estudio imponiendo una emulsión fotográfica sensible a la radiación radiactiva sobre el objeto. Las sustancias radiactivas contenidas en el objeto. tomando fotos de ellos mismos(de ahí el nombre). El método de autorradiografía se utiliza ampliamente en física y tecnología, en biología y medicina, dondequiera que se utilicen trazadores isotópicos.
Tras revelar y fijar la emulsión fotográfica, se obtiene sobre ella una imagen que muestra la distribución objeto de estudio. Hay varias formas de aplicar emulsión fotográfica a un objeto. Se puede aplicar directamente una placa fotográfica a la superficie pulida de la muestra, o se puede aplicar una emulsión líquida tibia a la muestra, que, cuando se solidifica, forma una capa estrechamente adyacente a la muestra y se examina después de la exposición y el fotoprocesamiento. La distribución de las sustancias radiactivas se estudia comparando densidad de ennegrecimiento de la película de la muestra de prueba y de referencia(la llamada macrorradiografía).
Segundo método consiste en contar las trazas formadas por partículas ionizantes en una emulsión fotográfica, utilizando óptico o microscopio electrónico (microradiografía). Este método es mucho más sensible que el primero. Para la obtención de macroautografías se utilizan emulsiones de transparencias y de rayos X, y para microautografías se utilizan emulsiones especiales de grano fino.
Una imagen fotográfica de la distribución de sustancias radiactivas en el objeto de estudio, obtenida por autorradiografía, se llama autorradiograma o radioautografia.
La introducción de compuestos marcados con radioisótopos en el cuerpo y el examen posterior de tejidos y células mediante autorradiografía permite:
- obtener información precisa sobre cuáles células o estructuras celulares, ocurren ciertos procesos,
- sustancias localizadas,
- establecer los parámetros de tiempo para una serie de procesos.
Por ejemplo, el uso de fósforo radiactivo y la autorradiografía permitieron detectar la presencia de un metabolismo intensivo en el hueso en crecimiento; el uso de yodo radiactivo y autorradiografía permitió aclarar los patrones de actividad de la glándula tiroides; la introducción de compuestos marcados, precursores de proteínas y ácidos nucleicos, y la autorradiografía ayudaron a aclarar el papel de ciertas estructuras celulares en el intercambio de estos compuestos vitales. El método de autorradiografía permite determinar no solo la localización de un radioisótopo en un objeto biológico, sino también su cantidad, ya que el número de granos de plata reducidos de la emulsión es proporcional al número de partículas que lo afectan. Análisis cuantitativo los macroautógrafos se llevan a cabo mediante los métodos habituales de fotometría y los microautógrafos, contando bajo un microscopio granos de plata o rastros-pistas que han surgido en la emulsión bajo la acción de partículas ionizantes. La autoradiografía comienza a combinarse con éxito con la microscopía electrónica
