Neue gentechnisch veränderte Proteine basierend auf rekombinanten Anti-TNF-Antikörpern Efimov Grigory Aleksandrovich. Gentechnische Methoden zur Gewinnung rekombinanter Proteine Gentechnisch veränderte Proteine
Gentechnik ist die In-vitro-Konstruktion von funktionell aktiven genetischen Strukturen (rekombinante DNA), oder mit anderen Worten, die Schaffung künstlicher genetischer Programme (Baev A.A.). Laut E. S. Die Gentechnik von Piruzyan ist ein System experimenteller Methoden, die es ermöglichen, künstliche genetische Strukturen im Labor (in vitro) in Form sogenannter rekombinanter oder hybrider DNA-Moleküle zu konstruieren.
Gentechnik ist die Herstellung neuer Kombinationen von genetischem Material durch Manipulation von Nukleinsäuremolekülen außerhalb der Zelle und Übertragung der erzeugten Genkonstrukte auf einen lebenden Organismus, was zu ihrem Einschluss und ihrer Aktivität in diesem Organismus und in seinen Nachkommen führt. Wir sprechen von einem nach einem vorgegebenen Programm gesteuerten Aufbau molekulargenetischer Systeme außerhalb des Körpers mit anschließender Einführung in einen lebenden Organismus. In diesem Fall wird rekombinante DNA zu einem integralen Bestandteil des genetischen Apparats des Empfängerorganismus und verleiht ihm neue einzigartige genetische, biochemische und dann physiologische Eigenschaften.
Das Ziel der angewandten Gentechnik ist es, solche rekombinanten DNA-Moleküle zu entwerfen, die, wenn sie in den genetischen Apparat eingeführt werden, dem Körper Eigenschaften verleihen, die für den Menschen nützlich sind. Zum Beispiel die Gewinnung „biologischer Reaktoren“ – Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere, die für den Menschen pharmakologisch bedeutsame Substanzen produzieren, die Schaffung von Pflanzensorten und Tierrassen mit bestimmten für den Menschen wertvollen Eigenschaften. Gentechnische Methoden ermöglichen es, genetische Zertifizierungen durchzuführen, genetische Krankheiten zu diagnostizieren, DNA-Impfstoffe herzustellen und Gentherapien für verschiedene Krankheiten durchzuführen.
Die rekombinante DNA-Technologie verwendet die folgenden Methoden:
Spezifische Spaltung von DNA durch Restriktionsnukleasen, wodurch die Isolierung und Manipulation einzelner Gene beschleunigt wird;
Schnelle Sequenzierung aller Nukleotide eines gereinigten DNA-Fragments, wodurch Sie die Grenzen des Gens und der davon codierten Aminosäuresequenz bestimmen können;
Konstruktion von rekombinanter DNA;
Nukleinsäure-Hybridisierung, die den Nachweis spezifischer RNA- oder DNA-Sequenzen mit größerer Genauigkeit und Empfindlichkeit ermöglicht, basierend auf ihrer Fähigkeit, komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu binden;
DNA-Klonierung: In-vitro-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion oder Einbringen eines DNA-Fragments in eine Bakterienzelle, die nach einer solchen Transformation dieses Fragment in Millionen von Kopien reproduziert;
Einschleusen von rekombinanter DNA in Zellen oder Organismen.
Der Aufbau rekombinanter Moleküle erfolgt mit Hilfe einer Reihe von Enzymen, hauptsächlich Restriktionsenzymen. Derzeit werden über 400 verschiedene Restriktionen verwendet. Diese Enzyme synthetisieren eine Vielzahl von Mikroorganismen.
Restriktionsenzyme erkennen und spalten spezifische Nukleotidsequenzen im doppelsträngigen DNA-Molekül. Restriktionsenzyme allein reichen jedoch nicht für das molekulare Klonen aus, da die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den vier Basen, die die klebrigen Enden bilden, nicht stark genug sind, um die beiden kombinierten DNA-Fragmente zu halten.
Ein Teil des rekombinanten DNA-Moleküls trägt das gewünschte Gen, das geklont werden soll, der andere enthält die Informationen, die für die Replikation der rekombinanten DNA in der Zelle notwendig sind.
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Protein Engineering ist ein Zweig der Biotechnologie, der sich mit der Entwicklung nützlicher oder wertvoller Proteine beschäftigt. Dies ist eine relativ neue Disziplin, die sich auf die Untersuchung der Proteinfaltung und die Prinzipien der Proteinmodifikation und des Proteindesigns konzentriert.
Es gibt zwei Hauptstrategien für das Protein-Engineering: gerichtete Proteinmodifikation und gerichtete Evolution. Diese Methoden schließen sich nicht gegenseitig aus; Forscher verwenden oft beides. In Zukunft könnten detailliertere Kenntnisse der Struktur und Funktion von Proteinen sowie Fortschritte in der Hochtechnologie die Möglichkeiten des Protein-Engineering erheblich erweitern. So können dank einer neuen Methode, die es ermöglicht, neue Aminosäuren in den genetischen Code aufzunehmen, sogar nicht natürliche Aminosäuren aufgenommen werden.
Protein-Engineering entstand an der Schnittstelle von Proteinphysik und -chemie und Gentechnik. Es löst das Problem, modifizierte oder hybride Proteinmoleküle mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen. Ein natürlicher Weg zur Umsetzung einer solchen Aufgabe ist die Vorhersage der Struktur des Gens, das das modifizierte Protein kodiert, die Durchführung seiner Synthese, Klonierung und Expression in Empfängerzellen.
Die erste kontrollierte Modifikation eines Proteins wurde Mitte der 1960er Jahre von Koshland und Bender durchgeführt. Um im aktiven Zentrum der Protease Subtilisin die Hydroxylgruppe durch eine Sulfhydrylgruppe zu ersetzen, nutzten sie die Methode der chemischen Modifikation. Wie sich jedoch herausstellte, behält ein solches Thiolsubtilisin die Proteaseaktivität nicht bei.
Protein ist chemisch gesehen ein gleichartiges Molekül, das eine Polyaminosäurekette oder ein Polymer ist. Es besteht aus Aminosäuresequenzen von 20 Typen. Nachdem die Menschen die Struktur von Proteinen kennengelernt hatten, stellten sie sich die Frage: Ist es möglich, völlig neue Aminosäuresequenzen so zu entwerfen, dass sie die Funktionen, die ein Mensch benötigt, viel besser erfüllen als gewöhnliche Proteine? Aus dieser Idee entstand der Name Protein Engineering.
Sie begannen bereits in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts über eine solche Technik nachzudenken. Dies geschah unmittelbar nach der Entschlüsselung der ersten Protein-Aminosäuresequenzen. In vielen Laboratorien der Welt wurden Versuche unternommen, die Natur zu kopieren und absolut willkürlich gegebene Polyaminosäuresequenzen chemisch zu synthetisieren.
Dies gelang vor allem dem Chemiker B. Merrifield. Dem Amerikaner ist es gelungen, eine äußerst effiziente Methode zur Synthese von Polyaminosäureketten zu entwickeln. Merrifield wurde dafür 1984 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.
Abbildung 1. Funktionsschema des Protein Engineering
Der Amerikaner begann, kurze Peptide zu synthetisieren, darunter auch Hormone. Gleichzeitig baute er einen Automaten – einen „chemischen Roboter“ – dessen Aufgabe es war, künstliche Proteine herzustellen. Der Roboter sorgte in Wissenschaftskreisen für Aufsehen. Es wurde jedoch schnell klar, dass seine Produkte nicht mit dem konkurrieren konnten, was die Natur hervorbringt.
Der Roboter konnte die Aminosäuresequenzen nicht genau reproduzieren, war also falsch. Er synthetisierte eine Kette mit einer Sequenz und die andere mit einer leicht modifizierten. In einer Zelle sind im Idealfall alle Moleküle eines Proteins einander ähnlich, das heißt, ihre Sequenzen sind exakt gleich.
Es gab auch ein anderes Problem. Selbst die Moleküle, die der Roboter korrekt synthetisierte, nahmen nicht die räumliche Form an, die für das Funktionieren des Enzyms notwendig ist. So hat der Versuch, die Natur durch die üblichen Methoden der organischen Chemie zu ersetzen, zu sehr bescheidenen Erfolgen geführt.
Wissenschaftler mussten von der Natur lernen und nach den notwendigen Modifikationen von Proteinen suchen. Der Punkt dabei ist, dass in der Natur ständig Mutationen auftreten, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenzen von Proteinen führen. Wenn wir Mutanten mit den notwendigen Eigenschaften auswählen, die dieses oder jenes Substrat effizienter verarbeiten, ist es möglich, aus einer solchen Mutante ein verändertes Enzym zu isolieren, wodurch die Zelle neue Eigenschaften erhält. Aber dieser Prozess dauert sehr lange.
Alles änderte sich, als die Gentechnik auftauchte. Dank ihr begannen sie, künstliche Gene mit einer beliebigen Nukleotidsequenz zu erstellen. Diese Gene wurden in vorbereitete Vektormoleküle eingefügt und diese DNAs wurden in Bakterien oder Hefe eingeführt. Dort wurde dem künstlichen Gen eine Kopie der RNA entnommen. Als Ergebnis wurde das gewünschte Protein produziert. Fehler in der Synthese wurden ausgeschlossen. Die Hauptsache war, die richtige DNA-Sequenz auszuwählen, und dann erledigte das enzymatische System der Zelle selbst einwandfrei seine Arbeit. Daraus können wir schließen, dass die Gentechnik den Weg für die Proteintechnik in ihrer radikalsten Form geebnet hat.
Protein-Engineering-Strategien
Gezielte Proteinmodifikation. Bei der gezielten Modifikation eines Proteins nutzt der Wissenschaftler detaillierte Kenntnisse über Struktur und Funktion des Proteins, um die gewünschten Veränderungen vorzunehmen. Im Allgemeinen hat dieses Verfahren den Vorteil, kostengünstig und technisch unkompliziert zu sein, da ortsgerichtete Mutagenesetechniken gut entwickelt sind. Der Hauptnachteil besteht jedoch darin, dass Informationen über die detaillierte Struktur eines Proteins oft fehlen, und selbst wenn die Struktur bekannt ist, kann es sehr schwierig sein, die Auswirkungen verschiedener Mutationen vorherzusagen.
Softwarealgorithmen zur Proteinmodifikation versuchen, neue Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die wenig Energie benötigen, um eine vorbestimmte Zielstruktur zu bilden. Während die zu findende Sequenz groß ist, ist die größte Herausforderung für die Proteinmodifikation ein schneller, aber präziser Weg, um die optimale Sequenz im Gegensatz zu ähnlichen suboptimalen Sequenzen zu identifizieren und zu bestimmen.
Gerichtete Evolution. Bei der gerichteten Evolution wird zufällige Mutagenese auf ein Protein angewendet und eine Auswahl getroffen, um Varianten mit bestimmten Eigenschaften auszuwählen. Weitere Mutations- und Selektionsrunden werden angewendet. Dieses Verfahren ahmt die natürliche Evolution nach und liefert im Allgemeinen hervorragende Ergebnisse für die gerichtete Modifikation.
Eine zusätzliche Technik, bekannt als DNA-Shuffling, mischt und bringt Teile erfolgreicher Varianten heraus, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Dieser Prozess ahmt die Rekombinationen nach, die natürlicherweise während der sexuellen Fortpflanzung auftreten. Der Vorteil der gerichteten Evolution besteht darin, dass keine Vorkenntnisse über die Proteinstruktur erforderlich sind und auch nicht, um vorhersagen zu können, welche Auswirkungen eine bestimmte Mutation haben wird. Tatsächlich sind die Ergebnisse der gerichteten Evolutionsexperimente überraschend, da die gewünschten Veränderungen oft durch Mutationen verursacht werden, die einen solchen Effekt nicht haben sollten. Der Nachteil ist, dass dieses Verfahren einen hohen Durchsatz erfordert, der nicht für alle Proteine möglich ist. Eine große Menge an rekombinanter DNA muss mutiert werden und die Produkte müssen auf die gewünschte Qualität gescreent werden. Die schiere Anzahl an Optionen erfordert oft den Kauf von Robotern, um den Prozess zu automatisieren. Außerdem ist es nicht immer einfach, auf alle interessierenden Merkmale hin zu screenen.
In den oben diskutierten Peptidbibliotheken sind letztere kovalent an das Trägerprotein gebunden. In dieser Form gehören sie zu den Vertretern der gentechnologisch gewonnenen Hybridproteine.
In einem anderen Fall werden Fusionsproteine verwendet, um aufgrund der Stabilisierung dieser Peptide innerhalb der Fusionsproteine ein hohes Expressionsniveau von kurzen Peptiden in Bakterienzellen zu erhalten. Fusionsproteine werden häufig verwendet, um schwer nachweisbare rekombinante Proteine zu identifizieren und zu reinigen. Durch Anbringen von -Galactosidase als Reporterprotein an den C-Terminus des untersuchten Proteins ist es beispielsweise möglich, das rekombinante Protein durch die Aktivität von -Galactosidase zu reinigen und seine antigenen Determinanten durch immunchemische Methoden zu bestimmen. Durch Verknüpfung von DNA-Fragmenten, die offene Leserahmen (ORFs) enthalten, mit Reporterproteingenen ist es möglich, solche Fusionsproteine auf Reporterproteinaktivität zu reinigen und sie zur Immunisierung von Labortieren zu verwenden. Die resultierenden Antikörper werden dann verwendet, um das native Protein zu reinigen, das das durch den ORF codierte rekombinante Polypeptid enthält, und dadurch das klonierte Genfragment zu identifizieren.
Mit Hilfe von Hybridproteinen wird auch das umgekehrte Problem gelöst, ein unbekanntes Gen zu klonieren, gegen dessen Proteinprodukt sich Antikörper befinden. In diesem Fall wird eine Klonbibliothek von Nukleotidsequenzen, die ORFs unbekannter Gene darstellen, in Vektoren konstruiert, die es ermöglichen, dass der klonierte ORF im selben Leseraster wie das Reportergen verknüpft wird. Die aus der Expression dieser rekombinanten Gene resultierenden Hybridproteine werden unter Verwendung von Antikörpern durch Enzymimmunoassay-Verfahren identifiziert. Hybridgene, die sezernierte Proteine und Reporterproteine kombinieren, ermöglichen es, die Mechanismen der Sekretion sowie die Lokalisierung und Bewegung sezernierter Proteine in Geweben auf neue Weise zu erforschen.
Hybride Toxine
Eine Reihe von Arbeiten von I. Pastan und seinen Mitarbeitern zum Design zielgerichteter Hybridtoxine veranschaulicht perfekt die Möglichkeiten des Protein-Engineerings in Bezug auf die Kombination verschiedener funktioneller Domänen von Proteinen, um spezifische biologische Wirkungen zu erzielen.
Reis. II.22. Zielgerichtete Medikamente auf Basis von Hybridtoxinen
a- ein verallgemeinertes Schema der Struktur eines Arzneimittels mit gerichteter Wirkung; b– die Struktur des pseudomonadischen Toxins (die Zahlen geben die Position der Aminosäurereste an); in– die Struktur des Hybridtoxins; G– Hybridtoxin basierend auf monoklonalen Antikörpern
Ein ideales Medikament mit streng spezifischer selektiver Wirkung sollte mindestens die folgenden strukturellen und funktionellen Merkmale aufweisen (Abb. II.22, a). Ein solches Medikament muss einen Wirkstoff enthalten, um eine physiologische Wirkung zu erzielen, und einen Liganden, der einen Rezeptor auf der Oberfläche von Zielzellen erkennt. Darüber hinaus muss es Strukturelemente enthalten, die vom Transportsystem des Körpers für die Arzneimittelabgabe an Zielzellen erkannt werden, sowie eine Abstandsstelle, die erforderlich ist, um den Wirkstoff von den verbleibenden funktionellen Teilen des Arzneimittels zu trennen, nachdem es an die Adresse geliefert wurde. Dieses ideale Schema ist im natürlichen Exotoxin von Pseudomonas aeruginosa verwirklicht. Exotoxin A von P. aeruginosa ist ein Protein, das aus einer einzigen Polypeptidkette von 613 Aminosäuren Länge besteht, die in drei funktionelle Domänen organisiert ist (siehe Abb. II.22, b). Die N-terminale Domäne Ia (Aminosäurereste 1–252) ist für die Wechselwirkung mit der Oberfläche von Zielzellen erforderlich (ein Prototyp-Ligand für ein ideales zielgerichtetes Medikament). Die Funktionen der Domäne Ib (Aminosäurereste 365–404) sind derzeit unbekannt. Domäne II (Aminosäurereste 253–364) sorgt für einen effizienten Transfer des Toxins zum Zellzytosol (Arzneistofftransportsystem), und Domäne III (Aminosäurereste 405–613) führt die ADP-Ribosylierung des Translationselongationsfaktors EF2 durch, der führt zur Unterdrückung von Translations- und Zelltodzielen. Damit Exotoxin A zytotoxisch wirken kann, ist es also notwendig, Rezeptoren auf der Zelloberfläche mittels Domäne Ia zu erkennen, mittels rezeptorvermittelter Endozytose in die Zelle einzudringen und durch die innere Membran in das Zytosol zu translozieren, wo der EF2-Faktor lokalisiert ist. Die Hauptidee bei der Herstellung zielgerichteter Toxine war, die Domäne Ia durch einen anderen Peptidliganden zu ersetzen, der mit einer anderen Gruppe von Rezeptoren auf der Zelloberfläche interagiert und dadurch die Spezifität der Wirkung des Toxins in Bezug auf die Zellen selbst verändert (siehe Abb. II. 22, in).
Es wurde gefunden, dass die Entfernung der Domäne Ia durch gentechnische Verfahren dramatisch (hundert- und tausendfach) die Toxizität eines solchen verkürzten Proteins sowohl gegenüber Zellen verschiedener Linien als auch in vivo reduziert. Die Anheftung an den C-terminalen Teil des verkürzten Polypeptids des humanen Interleukin-2-Moleküls erfolgte durch Kombination der Strukturteile der entsprechenden Gene im Expressionsvektor. Das gereinigte Hybridtoxin erwies sich als extrem toxisch für Zellen, die Interleukin-2-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen, und wirkte nicht auf Zellen, denen diese Rezeptoren fehlten und die unter der Wirkung des natürlichen Toxins starben. Verinnerlichung(Translokation in Zellen) des Hybridtoxins wurde durch die p55- und p70-Untereinheiten des Interleukin-2-Rezeptors vermittelt.Als Ergebnis der Wirkung des Hybridtoxins auf eine Zellpopulation, von denen einigeInterleukin-2-Rezeptoren auf ihren exprimieren, wurde daher eine Zellpopulation verursacht Oberfläche, kommt es zum selektiven Tod dieser Zellen.
Im Körper exprimieren die meisten Ruhe- und Gedächtnis-T-Zellen keine hochaffinen Interleukin-2-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, während mit Alloantigenen stimulierte T-Zellen solche Rezeptoren enthalten. Daher verringerte die intraperitoneale Verabreichung des Hybridtoxins an Ratten mit experimenteller Arthritis, einer Krankheit, die durch pathologische T-Zell-Aktivierung verursacht wird, die Symptome der Krankheit. Das Hybridtoxin reduzierte auch bei Mäusen signifikant die Transplantatabstoßung.
Diesen bahnbrechenden Arbeiten folgte eine ganze Reihe von Studien, die darauf abzielten, ähnliche Systeme zur gezielten Abgabe verschiedener zytotoxischer Polypeptide zu schaffen. Bei der weiteren Verbesserung des Systems zur gezielten Abgabe des Pseudomonas-Toxins unter Verwendung von Interleukin 2 als Ligand verzichteten sie auf die vollständige Entfernung der Zieldomäne des Toxins und beschränkten sich auf dessen Inaktivierung, indem sie vier ortsspezifische Mutationen in die einführten Toxin-Gen. Moleküle dieses Hybridtoxins erwiesen sich als 10- bis 100-mal wirksamere zytotoxische Mittel gegen menschliche und Affenzellen, die auf ihrer Oberfläche Rezeptoren für Interleukin 2 exprimieren, und hatten auch eine signifikant längere Halbwertszeit im Blut von Mäusen in vivo im Vergleich zu den zuvor erhaltenes Konstrukt.
Auf der Basis von Pseudomonas-Toxin wurden Hybridtoxine hergestellt, die als Liganden Polypeptidketten von Interleukin 4, Interleukin 6, transformierendem Wachstumsfaktor Typ und insulinähnlichem Wachstumsfaktor I enthielten und eine hochspezifische Zytotoxizität gegen Tumorzellen (einschließlich menschlicher Myelomzellen) zeigten für all diese Hybridproteine. ) mit entsprechenden Rezeptoren. Die Verwendung eines Teils der CD4-Polypeptidkette als Ligand im Hybridtoxin, einem Glykoprotein der Oberfläche von T-Zellen, das der Rezeptor des HIV-Virus ist und mit seinem Glykoprotein gp120 interagiert, ermöglichte die selektive Infektion von T-Zellen mit dem HIV-Virus infiziert sind und das virale gp120-Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Das gleiche Prinzip der Unterdrückung einer durch HIV-Viren verursachten Infektion durch lösliche CD4-Rezeptoren wurde bei der Konstruktion von Hybridproteinen verwendet, die Teile von CD4-Polypeptidketten mit konstanten Teilen von schweren oder leichten Ketten menschlicher Immunglobuline kombinieren. Gleichzeitig wurden beim Kombinieren von Genen die Nukleotidsequenzen entfernt, die die Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen von CD4 sowie den variablen Teil der Polypeptidketten von Immunglobulinen codieren. Die dabei entstehenden Hybridmoleküle, sog Immunadhäsine Aufgrund des konstanten Teils des Immunglobulinmoleküls erlangten sie eine erhöhte Stabilität im Körper und behielten außerdem spezifische Eigenschaften bei, die durch die konstanten Teile von Immunglobulinen vermittelt werden: Bindung des Fc-Rezeptors und Protein A, die Fähigkeit, Komplement zu fixieren und zu übertragen durch die Plazentaschranke. Die Kombination all dieser Eigenschaften ermöglichte es Immunadhäsinen, die Infektion von T-Zellen mit dem HIV-I-Virus effektiv zu unterbrechen, indem sie sowohl das Virus selbst als auch die von ihm infizierten Zellen blockierten und das virale gp120-Antigen auf ihrer Oberfläche exprimierten.
Eine weitere Verbesserung gentechnisch hergestellter Konstrukte auf der Basis von Pseudomonas-Exotoxin A erfolgte, nachdem begonnen wurde, die variablen Domänen von monoklonalen Antikörpern gegen die p55-Komponente des menschlichen Interleukin-2-Rezeptors als Zielteil des Hybridtoxins zu verwenden. In diesem rekombinanten Protein wurde ein 15-mer Peptidaminosäurelinker verwendet, um die variable Domäne der schweren Kette dieses Immunglobulins mit der variablen Domäne seiner leichten Kette und den C-Terminus der leichten Kette mit dem N-Terminus zu verbinden des verkürzten Pseudomonas-Toxins (siehe Abb. II.22, G). Solche hybriden Toxinmoleküle erwiesen sich auch als hochspezifische zytotoxische Mittel gegen menschliche Leukämiezellen, die Interleukin-2-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Der entwickelte Ansatz demonstrierte die Möglichkeit, spezifische Antikörper als Zielbestandteile von Hybridtoxinen zu verwenden. Damit steht den Forschern eine universelle Methode zur gezielten Abgabe von Toxinen zur Verfügung, die es künftig ermöglicht, zytotoxisch auf beliebige Zellgruppen zu wirken, die spezifische Antigene auf ihrer Oberfläche exprimieren, d.h. die Zahl der Angriffspunkte für chemotherapeutische Wirkungen unter Verwendung rekombinanter Proteine deutlich erweitern.
Neben Pseudomonas-Exotoxin A wurden Diphtherietoxin, Tumornekrosefaktor und die Ricin-A-Kette erfolgreich als Wirkstoffe in Hybridtoxinen verwendet. Da das A-Protein selektiv mit den konstanten (Fc) Teilen der Immunglobuline der G-Klasse vieler Säugetiere wechselwirkt, bindet ein solches Hybridtoxin, gepaart mit einem Immunglobulin, das gegen ein Antigen auf der Zelloberfläche hergestellt wurde, selektiv an diese Zellen und tötet diese ab. Solche Immuntoxine sind ein weiteres potentielles Antitumormittel und können gegen Zellen verwendet werden, die spezifische Antigene auf ihrer Oberfläche exprimieren.
Reis. II.23. Verwendung eines Fusionsproteins zur Regulierung der Genexpression
Gentechnische Methoden eröffnen endlose Möglichkeiten zur Konstruktion neuer Proteine, indem verschiedene funktionelle Domänen von Polypeptidketten in verschiedenen Kombinationen kombiniert werden. Die Herstellung zielgerichteter Hybridtoxine veranschaulicht die Möglichkeiten eines solchen Ansatzes im Protein-Engineering. Als abschließende Illustration der Möglichkeiten dieser Methodengruppe betrachten wir ein Hybridprotein als neuen Regulator der Genaktivität. Bei der gentechnischen Konstruktion eines solchen Proteins wurde die DNA-bindende Domäne im Glucocorticoid-Hormonrezeptor durch die entsprechende Domäne des E. coli LexA-Repressors ersetzt (Abb. II.23).
Einführung der Genoperatorsequenz lexA in die Promotorregion des Globingens (oder anderer Gene) führte zur Aktivierung des Promotors unter der Wirkung eines Hybridproteins in Gegenwart von Dexamethason, einem synthetischen Hormon, das mit dem Glucocorticoidrezeptor interagiert. Somit ist in der neuen genetischen Umgebung die Nukleotidsequenz des Genoperators lexA E. coli fungierte als Transkriptionsverstärker in Gegenwart eines Fusionsaktivatorproteins, das diese Sequenz erkennt. Die Ergebnisse der Arbeit demonstrieren die Möglichkeit, neue Proteine – Regulatoren der Genaktivität – durch Kombinieren bekannter Funktionsdomänen zu schaffen.
Die Entwicklung des Protein-Engineering wird weitgehend durch mangelndes Wissen über die strukturellen und funktionellen Zusammenhänge in Proteinen behindert, was auf die Komplexität des Untersuchungsgegenstandes zurückzuführen ist. Zahlreiche Arbeiten, die auf die Untersuchung solcher Beziehungen abzielen, sind in der Regel empirischer Natur und enden mit der Lokalisierung von Aminosäuren, die für das Funktionieren der aktiven Zentren von Enzymen wesentlich sind. Daher ist die Hauptaufgabe des Protein-Engineerings – aus einer bekannten Abfolge von Aminosäureresten ein Protein mit gewünschten Eigenschaften zu erhalten – derzeit noch lange nicht gelöst. Dennoch ist es manchmal schon jetzt möglich, einige Eigenschaften bestehender Enzyme gezielt zu verändern, indem eine kleine Anzahl von Aminosäureresten ihrer Polypeptidketten durch ortsgerichtete Mutagenese ersetzt werden.
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Efimov Grigory Alexandrovich. Neue genetisch veränderte Proteine basierend auf rekombinanten Antikörpern gegen TNF: Dissertation... Kandidat der Biowissenschaften: 03.01.03 / Efimov Grigory Aleksandrovich [Ort der Verteidigung: Institut für Molekularbiologie benannt nach V.A. - 122 p.
Einführung
Literaturübersicht 9
1. Geschichte der Eröffnung tnf 9
2. Überfamilie tnf 10
3. Systemaufbau tnfnfr 12
4. tnf-Funktionen 15
5. Die Rolle von TNF bei der Pathogenese von rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen 16
6. Therapeutische Blockade tnf 18
7. Nebenwirkungen und Grenzen der Antiinf-Therapie 23
8. Neue Ansätze und Perspektiven für die tnf-Blockierung 25
Materialien und Methoden der Forschung 29
1. Herstellung und Charakterisierung eines neuartigen Anti-Mensch-tnf-Antikörpers mit einer einzelnen Domäne von Kamelen 29
Expression und Reinigung des Einzeldomänen-Antikörpers Vhh41 29
Bewertung der Bindung des Vhh41-Antikörpers an humanes TNF durch ELISA 30
Untersuchung der Wechselwirkung von Vhh41 und menschlichem TNF durch Oberflächenplasmaresonanz 31
Studien zur Fähigkeit von Vhh41, menschliches TNF 31 zu blockieren
2. Konstruktion, Herstellung und Charakterisierung von Hybridproteinen von TNF-Fluoreszenzsensoren 32
Konstruktion von Genen, die TNF-Sensoren codieren. 32
Expression und Reinigung von fluoreszierenden TNF-Sensoren. 33
Analyse der Wechselwirkung von Vhh41-K mit rekombinantem TNF. 34
Untersuchung der biologischen Eigenschaften des Fluoreszenzsensors Vhh41-KTNFin vitro und in vivo. Z5
Untersuchung der Fähigkeit eines Fluoreszenzsensors, TNF in vivo zu binden 36
In-vivo-Untersuchung der TNF-Expression unter Verwendung des resultierenden Fluoreszenzsensors...39
3. Herstellung und Charakterisierung eines einkettigen ANTINF-Antikörpers 40
Untersuchung des monoklonalen Maus-Antikörpers F10 40
Konstruktion und Expression des Einzelketten-Antikörpers ahT-4 41
Messung der biologischen Aktivität des einkettigen ahT-4-Antikörpers 42
4. Herstellung und Charakterisierung des chimären Anti-Inf-Antikörpers 43
5. Konstruktion, Herstellung und Charakterisierung von bispezifischen A9- und MA9-Antikörpern 43
Konstruktion, Expression und Reinigung der Antikörper A9 und tA9 43 Wechselwirkung der Antikörper A9 und tA9 mit rekombinantem humanem TNF-Verfahren
Oberflächenplasmaresonanz 44
Zytotoxizitätstest 45
Zytofluorimetrie 45
Bewertung der Fähigkeit des bispezifischen Antikörpers A9, humanes TNF zurückzuhalten
Oberfläche von Makrophagen 45
6. Vergleichende Bewertung der Wirksamkeit der systemischen und selektiven Blockierung von Makrophagen-TNF 46
Modell der durch Verabreichung von JIIJC/D-Galactosamin 46 induzierten akuten Hepatotoxizität
Ergebnisse und Diskussion 48
1. Gewinnung und Charakterisierung eines neuen rekombinanten Einzeldomänen-Antikörpers, der spezifisch an humanen TNF bindet, aber dessen biologische Aktivität nicht blockiert 50
Schaffung eines genetischen Konstrukts, das einen rekombinanten Einzeldomänen-Antikörper codiert
Expression und Reinigung des rekombinanten Einzeldomänen-Antikörpers Vhh41 52
Analyse der Wechselwirkung des Single-Domain-Antikörpers Vhh41 mit humanem TNF 53
Analyse der Fähigkeit des Vhh41-Antikörpers, die biologische Aktivität von menschlichem TNF.54 zu blockieren
2. Konstruktion, Produktion und Charakterisierung von molekularen TNF-Sensoren für die In-vivo-Untersuchung der TNF-Expression basierend auf rekombinanten Einzeldomänen-Antikörpern und rot fluoreszierendem Protein 56
Erhalten genetischer Konstrukte, die den TNF-Vhh41-Ku-Fluoreszenzsensor codieren
Kontrollfusionsproteine 56
Expression und Reinigung des TNF-Vhh41-K-Fluoreszenzsensors. 57
Analyse der Wechselwirkung des Fluoreszenzsensors TNF Vhh41-K mit rekombinantem Maus-TNF
und Mensch 58
Untersuchung der biologischen Eigenschaften des Fluoreszenzsensors TNF Vhh41-Kin vitro und in vivo. 61
Untersuchung der Fähigkeit eines fluoreszierenden Sensors, TNF in vivo zu binden 66
In-vivo-Untersuchung der TNF-Expression unter Verwendung des erhaltenen Fluoreszenzsensors ... 69
3. Herstellung und Charakterisierung eines rekombinanten Einzelketten-Antikörpers, der die biologische Aktivität von TNF 72 blockiert
Messung der Aktivität des monoklonalen Maus-Antikörpers F10 72
Konstruktion eines Einzelketten-Antikörpers basierend auf variablen Fragmenten der Lunge und
schwere Ketten des monoklonalen Maus-Antikörpers F 10 74
Messung der Aktivität des Single-Chain-Antikörpers ahT-4 75
4. Entwicklung und Analyse eines chimären Anti-Mensch-TNF-Antikörpers
Vergleich der Kinetik von Wechselwirkungen des chimären Antikörpers 13239 und Infliximab mit
rekombinanter humaner TNF 77 Vergleich der neutralisierenden Aktivität des chimären Antikörpers 13239 mit der von
Infliximab in vitro 79
Analyse der Aktivität des chimären Antikörpers 13239 in vivo 80
5. Design, Herstellung und Charakterisierung eines selektiven TNF-Blockers, der von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Reihe 82 produziert wird
Molekulares Klonen, Expression und Reinigung von bispezifischen Antikörpern 82
Wechselwirkung von A9- und mA9-Antikörpern mit rekombinantem humanem TNF 86
Die Antikörper A9 und rA9 blockieren die TNF-abhängige Zytotoxizität in vitro 87
Analyse der Bindung der Antikörper A9 und tA9 an die Oberfläche von Makrophagen durch Wechselwirkung mit
Oberflächenmolekül F4/80 89
Retention von endogen produziertem humanem TNF auf der Oberfläche von Makrophagen
bispezifischer Antikörper A9 93
6. Physiologisch signifikante selektive Blockierung von TNF, das von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Reihe in vivo produziert wird 96
Vergleichende Bewertung der Wirksamkeit der gezielten Blockierung von TNF, das von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Reihe produziert wird, und der systemischen Blockierung von TNF in einem akuten Modell
Hepatotoxizität 96
Fazit 99
Referenzen 100
Die Rolle von TNF bei der Pathogenese von rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen
Die ersten Erfahrungen mit der Anticytokin-Therapie wurden 1985 gemacht, als Mäusen polyklonales antiNF-Kaninchenserum injiziert wurde, was die Entwicklung einer durch LPS-Verabreichung induzierten tödlichen Hepatotoxizität verhinderte. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Affen erhalten: Paviane, denen ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen humanes TNF injiziert wurde, überlebten nach einer intravenösen Injektion einer tödlichen Dosis von E. coli [104].
Der erste therapeutische TNF-Blocker wurde aus einem hochaffinen monoklonalen Maus-Antikörper A2 entwickelt, der von Mäusen stammt, die mit menschlichem TNFα immunisiert wurden. Da Antikörper anderer Spezies signifikante Unterschiede in der Aminosäuresequenz aufweisen, sind sie für eine langfristige therapeutische Verwendung beim Menschen ungeeignet. Daher wurden durch Gentechnik die konstanten Domänen der schweren und leichten Ketten der Maus durch menschliche ersetzt. Die variablen Regionen, die das Antigen binden, blieben unverändert. Solche Antikörper werden als chimär bezeichnet. Anschließend erhielt dieser erste therapeutische Anti-TNF-Antikörper einen internationalen Freinamen – Infliximab.
Eine der offensichtlichsten Anwendungen der AntiNF-Therapie war die Behandlung von Sepsis. Klinische Studien zeigten jedoch keine signifikanten Ergebnisse, was offenbar darauf zurückzuführen ist, dass zum Zeitpunkt der Entwicklung des Krankheitsbildes einer Sepsis bereits irreversible Signalkaskaden ablaufen.
Zu diesem Zeitpunkt hatte sich bereits eine Menge Beweismaterial angesammelt, das auf die Beteiligung von TNF an der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis hinweist, sodass diese Krankheit als nächstes potenzielles Ziel für eine AntiNF-Therapie ausgewählt wurde. Pilotstudien mit Infliximab bei rheumatoider Arthritis haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt, und weitere randomisierte, doppelblinde Studien haben die Wirksamkeit der AntiNF-Therapie bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen bestätigt. Nach wiederholten Injektionen entwickelten einige Patienten jedoch Antikörper, die für Maus-Aminosäuresequenzen in den variablen Domänen spezifisch sind, was die Wirksamkeit der Therapie verringerte.
Eine doppelblinde, randomisierte Studie zeigte, dass Infliximab eine synergistische Wirkung mit niedrigen Dosen von Methotrexat hat, einem zytotoxischen Medikament, das als Monotherapie bei RA verwendet wird. In Kombination sind diese beiden Medikamente wirksamer und die Immunogenität von Infliximab wird reduziert. Nachfolgende klinische Phase-II/III-Studien führten zur Zulassung von Infliximab zur Behandlung von RA.
Der Wirkmechanismus von Infliximab beruht hauptsächlich auf der Bindung von löslichem TNF im systemischen Kreislauf und an Stellen lokaler Überexpression (Synovialhöhle bei RA). Aber zusätzlich ist Infliximab in der Lage, an die transmembranöse Form von TNF zu binden und durch den Mechanismus der Antikörper-abhängigen Zytotoxizität eine Lyse von Zellen zu verursachen, die es auf ihrer Oberfläche tragen.
Die AntiNF-Therapie unterbricht die pathologische Signalkaskade und führt zu einer Abnahme der Entzündungsreaktion, kann aber zusätzlich das fehlregulierte Immunsystem ausgleichen. Vor dem Hintergrund der Einführung von TNF-Inhibitoren verschiebt sich das Gleichgewicht von T-Effektor- und T-regulatorischen Zellen.
Die AntiNF-Therapie ist keine etiotrope Therapie und sollte theoretisch lebenslang angewendet werden, in einigen Fällen ist es jedoch möglich, eine stabile Remission zu erreichen, die auch nach Absetzen der AntiNF-Therapie anhält.
TNF-Blocker haben ihre Wirksamkeit bei der Behandlung anderer Autoimmun- und Entzündungserkrankungen gezeigt: Es konnte gezeigt werden, dass TNF eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von Morbus Crohn spielt – es wird in entzündeten Bereichen des Darms überexprimiert. Erste Erfolge bei der Behandlung des refraktären Morbus Crohn mit Infliximab wurden später in randomisierten klinischen Studien bestätigt, was zur Zulassung von Infliximab auch für diese Erkrankung führte.
Auch die Pathogenese der ankylosierenden Spondylitis (Morbus Bechterew), einer weiteren chronischen systemischen Autoimmunerkrankung, die vorwiegend die Gelenke betrifft, ist auf eine Überexpression von TNF zurückzuführen. Klinische Studien mit Infliximab waren auch für diese Krankheit erfolgreich. Darüber hinaus hat die AntiNF-Therapie eine hohe Wirksamkeit bei der Behandlung von Psoriasis und Psoriasis-Arthritis gezeigt.
Bisher sind Infliximab und andere TNF-Blocker als Therapeutika für folgende Autoimmunerkrankungen zugelassen: rheumatoide Arthritis, juvenile idiopathische Arthritis, Morbus Bechterew, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Psoriasis, Psoriasis-Arthritis. Darüber hinaus haben TNF-Antagonisten positive Ergebnisse bei der Behandlung von Sarkoidose, Wegener-Granulomatose, Morbus Behçet und anderen chronischen Erkrankungen gezeigt.
Hinweise, dass TNF eine Rolle in der Pathogenese der Multiplen Sklerose spielt, wurden durch Labortierversuche gestützt. Die Einführung von TNF verschlimmerte die Symptome der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Ratten, und die Einführung von AntiNF-Antikörpern verhinderte die Entwicklung dieser Krankheit.
Klinische Studien bei Multipler Sklerose mit Infliximab und einem anderen TNF-Blocker, Lenercept (lösliches TNFR1), führten jedoch zu keinem signifikanten klinischen Ansprechen. Darüber hinaus bei einigen Patienten
Eine Modell-Autoimmunerkrankung, deren Pathogenese der Multiplen Sklerose ähnelt. Es gab eine Zunahme der klinischen Symptome der Krankheit und eine Zunahme der Zellularität und des Spiegels von Immunglobulinen in der Zerebrospinalflüssigkeit, eine Zunahme der Anzahl von Herden in der Magnetresonanztomographie.
Der Erfolg von Infliximab hat die Entwicklung neuer Moleküle vorangetrieben, die in der Lage sind, die Signalübertragung durch den TNFR zu blockieren. Darüber hinaus verursachten Maussequenzen in den variablen Domänen der schweren und leichten Ketten von Infliximab bei einigen Patienten die Produktion von sekundären Antikörpern, die die Wirkung von Infliximab blockierten und die Patienten therapieresistent machten. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde ein Weg gewählt, um Inhibitoren mit vollständig menschlichen Aminosäuresequenzen zu schaffen.
Bisher sind neben Infliximab vier TNF-Antagonisten für die klinische Anwendung zugelassen (siehe Abbildung 2):
Etanercept ist ein rekombinanter TNF-Inhibitor, der aus löslichem TNFR2 hergestellt wird. Seine Entwicklung basierte auf Daten, dass eine lösliche Form des zweiten TNF-Rezeptors im menschlichen Körper vorhanden ist. Durch Metalloproteasen desquamiert, ist TNFR2 ein zusätzliches Bindeglied in der Regulation der TNF-Aktivität. Etanercept ist ein Dimer des extrazellulären Teils von TNFR2, das genetisch mit dem Fc-Fragment von IgG1-Immunglobulin fusioniert ist. Die Bindung an die konstante Region eines Antikörpers erhöht die systemische Halbwertszeit des Arzneimittels signifikant, indem das Protein durch den FcRn-Rezeptor recycelt wird. Die neutralisierende Aktivität des Fusionsproteins wurde sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Experimenten gezeigt und später in klinischen Studien bei Patienten mit rheumatoider Arthritis bestätigt.
Bei der Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen hat Etanercept jedoch im Gegensatz zu Infliximab keine therapeutische Wirksamkeit gezeigt. Ein experimenteller TNF-Blocker, Onercept, der auf einem anderen TNF-Rezeptor, TNFR1 (p55), basiert, zeigte trotz ermutigender klinischer Pilotstudien in einer randomisierten, placebokontrollierten Doppelblindstudie ebenfalls keine Wirksamkeit bei der Behandlung von Morbus Crohn. Eine In-vitro-Studie zur Untersuchung von T-Lymphozyten aus der Lamina propria von Patienten mit Morbus Crohn zeigte, dass zwar sowohl Infliximab als auch Etanercept TNF blockieren, aber nur Infliximab an T-Zellen in der Läsion bindet und dort Apoptose induziert. Dies könnte den Unterschied in der Wirksamkeit von Antikörper-basierten und rekombinanten Rezeptor-basierten Blockern bei entzündlichen Darmerkrankungen erklären.
Untersuchung der Wechselwirkung von Vhh41 und menschlichem TNF durch Oberflächenplasmaresonanz
Das genetische Konstrukt, das den bispezifischen A9-Antikörper codiert, wurde durch eine 4-Primer-GAP-Reaktion zusammengesetzt, die der oben für das ahT-4-Einzelketten-Antikörpergen beschriebenen ähnlich ist. Die resultierende Sequenz bestand aus: dem Einzeldomänen-AntiNF-Antikörper-Gen, dann der Sequenz, die den (Gly4Ser)3-Spezies-Linker codiert, und dem Einzelketten-Anti-P4/80-Antikörper-Gen (mit freundlicher Genehmigung von S. Gordon und M. Stacey). Die Restriktionserkennungsstellen NcoI und XhoI wurden in die Sequenz der Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer aufgenommen. Nach dem Restriktions-PCR-Produkt und dessen Klonierung in den Expressionsvektor pET-28b (Novagen) befand sich die für das Polyhexidin-Tag kodierende Sequenz am 3-Ende im gleichen Leseraster. Um den Kontrollantikörper wA9 zu erhalten, wurde das mutierte Anti-G4/80-scFv-Gen, das Glycin-Serin-Inserts anstelle von CDR-Sequenzen enthielt, de novo synthetisiert (Geneart, Deutschland) und anstelle des nativen Anti-F4/80-Gens kloniert (siehe Abb 31B).
Expressionsvektoren, die Inserts tragen, die A9 und shA9 codieren, wurden verwendet, um E. coli-Zellen des Rosetta2(DE3)pLysS-Stammes (Novagen) zu transformieren. Die besten Produzentenklone wurden durch Kolonie-Immunoblotting unter Verwendung von Nickel-konjugierter Peroxidase (Pierce, 15165) selektiert. Bakterienkulturen wurden in LB-Medium, das 50 cg/ml Carbenicillin (Sigma-C1389) und 50 cg/ml Chloramphenicol (Sigma-C1863) enthielt, bis zur logarithmischen Phase gezüchtet, und dann wurde die Expression durch 0,2 mM IPTG induziert. Nach 4 Stunden wurden die Kulturen einer Zentrifugation bei 3200 g für 30 min unterzogen. Die Pellets wurden eingefroren und dann in Lysepuffer (50 mM TrisHCl, 300 MM NaCl, 5 % Glycerol, 0,5 % Triton X-100 Detergens, 10000 U/ml Lysozym, 10 mM P-Mercaptoethanol) resuspendiert und dann mit einem Ultraschallhomogenisator desintegriert. Die Lysate wurden 40 min bei 17.000 g zentrifugiert, die Überstände gesammelt und durch einen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,22 cm filtriert. Die bispezifischen Antikörper A9 und tA9 wurden aus geklärten Überständen auf einer Chromatographiesäule gereinigt, die mit Ni-Nitriloessigsäure konjugierte Agarose (Invitrogen R90115) enthielt. Die Affinitätschromatographie wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Das resultierende Eluat wurde konzentriert, gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert, gefolgt von einer Filtration durch einen 0,22-&mgr;m-Filter. Die Proteinkonzentration in der Lösung wurde unter Verwendung der Reaktion mit 2,2-Bicinchoninsäure (PIERCE 23225-Kit) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Die Homogenität der resultierenden Präparation wurde durch Elektrophorese in 15 % Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat getestet, gefolgt von Coomassie-Färbung.
Wechselwirkung von A9- und mA9-Antikörpern mit rekombinantem humanem TNF durch Oberflächenplasmonresonanz.
Der Vergleich der Affinitäten und Kinetiken der Wechselwirkung von A9- und mA9-Antikörpern mit rekombinantem humanem TNF wurde auf einem ProteOn XPR36-Instrument (Bio-Rad) durchgeführt. Im Zuge der Messung aller Wechselwirkungen wurde phosphatgepufferte Kochsalzlösung (pH = 7,4) verwendet, der Tween 20 Detergens in einer Konzentration von 0,005 % zugesetzt wurde, die Oberflächentemperatur des Chips betrug 25 °C. Rekombinanter humaner TNF wurde darin exprimiert E. coli nach dem zuvor beschriebenen Verfahren. Die Antikörper A9 und tA9 wurden in einer Konzentration von 50 nM über die Aminogruppe auf der Oberfläche eines Biochips mit einer modifizierten Alginatpolymeroberfläche (Bio-Rad 176-5011) immobilisiert. Dann wurde der Analyt (humaner TNF) in fünf doppelt abnehmenden Konzentrationen (50 -3 nM) auf fünf parallele Kanäle aufgebracht. Der Puffer, der keine Antikörper enthielt, wurde zur Normalisierung in den sechsten Kanal eingeführt. Die Analyse der empfangenen Sensogramme wurde im Programm ProteOn Manager (Bio-Rad) unter Verwendung des Langmuir-Modells durchgeführt.
In Experimenten mit Peritonealmakrophagen wurden Peritonealhöhlenzellen aus Wildtyp (C57BL/6)-Mäusen isoliert und sofort unter Verwendung von Fluorochrom-kojugierten Antikörpern gefärbt. Um Knochenmarksmakrophagen zu erhalten, wurde das Knochenmark isoliert, wonach die Zellen für 10 Tage in einem konditionierten Medium (erhalten auf der L929-Linie) kultiviert wurden, dann wurden die Zellen mit eiskaltem Phosphatpuffer vom Plastik entfernt.
Vor dem Färben wurde der Fc-Gamma-Rezeptor blockiert, dann wurden die Zellen mit A9- oder tA9-Antikörpern oder Puffer inkubiert, wonach die Zellen gewaschen und auf eine von drei Arten gefärbt wurden: 1) polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen hTNF-VnH, dann mit sekundäre Antikörper gegen mit Fluorochrom konjugiertes Kaninchen-IgG. 2) monoklonale Maus-Antikörper gegen die Hexahistidin-Sequenz (Novagen – 70796), dann mit sekundären Antikörpern gegen Maus-IgG, konjugiert mit Fluorochrom. 3) Rekombinantes humanes TNF wurde zu den Zellen gegeben, gefolgt von monoklonalen AntiNF-Antikörpern (Miltenyi Biotec – Klon: cA2), die mit Fluorochrom markiert waren.
Zusätzlich wurden die Zellen mit Anti-P4/80- und Anti-CD-1-lb-Antikörpern gefärbt, die an Fluorochrome konjugiert waren. Die Proben wurden entweder auf einem F ACS Aria-Instrument (BDBiosciences) oder einem Guava EasyCyte 8HT (Millipore) analysiert und dann unter Verwendung der FlowJo-Software (Treestar Inc.) verarbeitet.
Bewertung der Fähigkeit des bispezifischen A9-Antikörpers, menschlichen TNF auf der Oberfläche von Makrophagen zurückzuhalten.
Peritoneale Makrophagen von Mäusen, die menschlichen TNF produzieren, wurden isoliert und mit 100.000 Zellen pro Vertiefung in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden für 2 h bei 37°C, 5 % CO 2 inkubiert, wonach die nicht angehefteten Zellen mit warmem Phosphatpuffer abgewaschen wurden. Die Zellen wurden dann über Nacht bei 37°C, 5% CO 2 inkubiert. Nach dem Waschen mit 200 &mgr;l warmem DMEM-Medium wurden die Zellen mit A9-Antikörpern bei einer Konzentration von 2 &mgr;g/ml oder mit DMEM-Medium für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach einem weiteren Waschen wurden die Zellen mit LPS (Sigma, L2630) bei einer Konzentration von 100 ng/ml stimuliert. Nach 4 Stunden wurden Kulturüberstände gesammelt und die menschliche TNF-Konzentration wurde unter Verwendung eines ELISA-Kits (eBioscience, 88-7346) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen.
Knochenmark von Mäusen, die menschlichen TNF produzieren, wurde isoliert, wonach die Zellen 10 Tage lang in einem konditionierten Medium (erhalten von Linie L929) kultiviert wurden, dann wurden die Zellen mit eiskaltem Phosphatpuffer aus dem Plastik entfernt. Die Zahl der lebenden Zellen wurde gezählt und sie wurden in einer Konzentration von 50.000 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 96 Vertiefungen gesetzt. Dann wurden 250 &mgr;M A9-Antikörper oder hTNF-VffH-Einzeldomänen-Antikörper oder Blindmedium (DMEM) zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit Antikörpern inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Danach wurde die TNF-Produktion durch LPS (Sigma – L2630) bei einer Konzentration von 100 ng/ml stimuliert. Nach 4 Stunden wurden die Überstände gesammelt, die TNF-Konzentration in ihnen wurde unter Verwendung eines zytotoxischen Tests an der Linie des Maus-Fibrosarkoms L929 gemäß dem Protokoll ähnlich dem oben beschriebenen gemessen.
Untersuchung der biologischen Eigenschaften des Fluoreszenzsensors Vhh41-KTNFin vitro und in vivo
Basierend auf experimentellen Daten, die an Mauslinien erhalten wurden, in denen das Tnf-Gen in getrennten Zellpopulationen deletiert ist, wurde eine Hypothese über die möglichen unterschiedlichen Funktionen von TNF formuliert, das von verschiedenen Arten von Immunozyten produziert wird. So wurde kürzlich gezeigt, dass in einem Modell einer experimentellen Tuberkuloseinfektion TNF, das von T-Lymphozyten, aber nicht von myeloiden Zellen produziert wird, eine einzigartige Schutzfunktion hat. Darüber hinaus wurden in unserem Labor Daten erhalten, die auf die pathogenen Eigenschaften von TNF aus myeloiden Zellen bei Autoimmunerkrankungen hinweisen. Die therapeutisch angewandte vollständige Blockierung der PMB berücksichtigt diese Merkmale nicht. Als Teil der Entwicklung dieser Hypothese wurde eine spezifische Hemmung von TNF gewählt, das von Zellen der Monozyten-Makrophagen-Reihe produziert wird, was einen signifikanten Vorteil gegenüber der systemischen Blockierung dieses Zytokins haben könnte. Insbesondere könnte ein intaktes Signal von TNF, das von B- und T-Lymphozyten produziert wird, das Auftreten von Nebenwirkungen verringern und darüber hinaus eine AntiNF-Therapie bei solchen Krankheiten wirksam machen, für die TNF-Blocker bisher keine klinische Wirksamkeit gezeigt oder sogar verursacht haben eine Zunahme der Symptome. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz möglicherweise die erforderliche Dosis durch gezielte Abgabe an Erzeugerzellen reduzieren.
Um diese Annahme zu testen, haben wir einen bispezifischen Antikörper entwickelt und getestet, der aufgrund der Wechselwirkung mit dem F4/80-Transmembranmolekül an einen Teil der Makrophagenoberfläche bindet und mit der anderen Spezifität den von ihnen produzierten TNF einfängt und blockiert.
Molekulares Klonen, Expression und Reinigung von bispezifischen Antikörpern. Der bispezifische Antikörper, ein selektiver Blocker von Makrophagen-TNF, wurde A9 genannt. Ein Einzeldomänen-blockierender AntiNF-Antikörper hTNF-VffH und ein Einzelketten-Antikörper (scFv) gegen den Makrophagen-Oberflächenmarker F4/80 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S. Gordon (Oxford University, UK) und M. Stacey (University of Leeds, UK) wurden verwendet, um ein dafür codierendes genetisches Konstrukt zu erzeugen.Die Sequenzen, die beide Antikörper codieren, wurden durch Polymerase-Kettenreaktion(PCR) amplifiziert und in einen Expressionsvektor kloniert, so dass sie im gleichenLeserahmen lagen, und eine Nukleotidsequenz, die ein flexibles Glycin-Serin codiert Zwischen ihnen wurde ein Linker (GSGGGGSG) gebildet.Die für das Histidin-Hexamer kodierende Sequenz befindet sich am C-Terminus derSequenz für die anschließende Reinigung des Proteins ( Fig. 31 ).
Das Design des bispezifischen A9-Antikörpers, eine schematische Darstellung seines Wirkungsmechanismus, die Struktur genetischer Konstrukte, die den bispezifischen A9-Antikörper und den systemischen Kontrollblocker von TNF, den tA9-Antikörper, codieren. (A) Der bispezifische A9-Antikörper besteht aus einem Einzeldomänen-Antikörper (VHH) gegen humanes TNF und einem Einzelketten-Antikörper (scFv) gegen das F4/80-Oberflächenmolekül, das auf Monozyten und Makrophagen exprimiert wird. (B) Das Prinzip der selektiven Blockierung von TNF, das von Makrophagen produziert wird: A9 bindet an die Oberfläche von Makrophagen und fängt TNF ein, das von ihrer Oberfläche freigesetzt wird, wodurch verhindert wird, dass es in den systemischen Kreislauf gelangt. (B) Diagramm des genetischen Konstrukts des bispezifischen A9-Antikörpers und des systemischen Kontroll-TNF-Blockers, tA9. Auf das Einzeldomänen-Anti-NF-Antikörper-Gen folgt eine Sequenz, die einen flexiblen Glycin-Serin-Linker codiert, und dann ein Einzelketten-Anti-F4/80-Antikörper-Gen. Darauf folgt eine Sequenz, die ein Histidin-Hexamer zur Affinitätsreinigung codiert. Der Kontroll-tA9-Antikörper hat eine ähnliche Sequenz, außer dass die 6 hypervariablen Regionen des Anti-P4/80-Antikörpers durch Sequenzen des (Gly3Ser)n-Typs ersetzt sind, was verhindert, dass der Antikörper an die Oberfläche von Makrophagen bindet und ihn in ein systemischer TNF-Hemmer.
Um die Wirkungen der spezifischen Blockierung von TNF, das von Makrophagen produziert wird, zu untersuchen, wurde ein systemischer Kontrollblocker benötigt. Um die mit Unterschieden in der Antikörperaffinität verbundenen Wirkungen zu vermeiden, wurde entschieden, einen Blocker mit einer ähnlichen A9-TNF-Bindungsstelle zu verwenden. Und um den Einfluss anderer Faktoren, insbesondere des isoelektrischen Punkts und des Molekulargewichts, die die Halbwertszeit beeinflussen können, auszuschließen, sollte der Kontrollantikörper in der primären Aminosäuresequenz dem zu untersuchenden Antikörper so nahe wie möglich kommen. Daher konstruierten wir einen Kontrollantikörper – tA9, der die gleiche Struktur und Aminosäuresequenz wie A9 hat, außer dass 6 seiner hypervariablen Regionen in Anti-P4/80-scFv durch Sequenzen des gleichen Typs (Gly3Ser)n ersetzt sind Länge als ursprüngliche CDR-Regionen (siehe Fig. 31B).
Beide Antikörper wurden im Bakteriensystem exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt.
Die Größe des A9-Antikörpers, bestimmt durch elektrophoretische Mobilität und HPLC-Daten, entsprach dem berechneten Molekulargewicht von 45 kDa (Fig. 32). Chromatographie. Links - die Werte des Molekulargewichts von Proteinen. (B) Chromatogramm des bispezifischen A9-Antikörpers (rot markiert), das dem Chromatogramm der Molekulargewichtsmarker überlagert ist. (B) Funktion der Laufzeit eines Moleküls als Funktion des Molekulargewichts. Das berechnete Molekulargewicht des bispezifischen A9-Antikörpers betrug 43,4 kDa.
Wechselwirkung von A9- und tA9-Antikörpern mit rekombinantem humanem TNF. Die Interaktionskinetik von A9- und mA9-Antikörpern mit rekombinantem humanem TNF wurde durch Oberflächenplasmonresonanz gemessen. Dazu wurden beide Antikörper in einer Konzentration von 50 nM auf der Oberfläche des Sensorchips immobilisiert, anschließend rekombinanter humaner TNF in Verdünnungsreihen von 50–3 nM als Analyt aufgetragen und die Interaktionskinetik auf einem ProteOn gemessen XPR36-Instrument. Beide Antikörper zeigten eine hohe Affinität: Kd von A9 und tA9 betrug 85 bzw. 95 pM. Dies bestätigt, dass die eingeführten Mutationen die TNF-Bindung nicht beeinflussten. Außerdem hatten beide Antikörper ähnliche Parameter der Bindungsrate (Kforward, On-Rate) und der Dissoziationsrate (Kreverse, Off-Rate) – gezeigt in Abb. 33 und in Tab. 3. Die langsame Dissoziationsrate sollte es dem A9-Antikörper ermöglichen, gebundenen TNF zurückzuhalten.
Herstellung und Charakterisierung eines neuen rekombinanten Einzeldomänen-Antikörpers, der spezifisch an humanen TNF bindet, aber dessen biologische Aktivität nicht blockiert
Die Interaktionskinetik von A9- und mA9-Antikörpern mit rekombinantem humanem TNF wurde durch Oberflächenplasmonresonanz gemessen. Dazu wurden beide Antikörper in einer Konzentration von 50 nM auf der Oberfläche des Sensorchips immobilisiert, anschließend rekombinanter humaner TNF in Verdünnungsreihen von 50–3 nM als Analyt aufgetragen und die Interaktionskinetik auf einem ProteOn gemessen XPR36-Instrument. Beide Antikörper zeigten eine hohe Affinität: Kd von A9 und tA9 betrug 85 bzw. 95 pM. Dies bestätigt, dass die eingeführten Mutationen die TNF-Bindung nicht beeinflussten. Außerdem hatten beide Antikörper ähnliche Parameter der Bindungsrate (Kforward, On-Rate) und der Dissoziationsrate (Kreverse, Off-Rate) – dargestellt in Abb. 33 und in Tab. 3. Die langsame Dissoziationsrate sollte es dem A9-Antikörper ermöglichen, gebundenen TNF zurückzuhalten.
Kinetik der Wechselwirkung des bispezifischen Antikörpers A9 und des Kontrollantikörpers tA9 mit rekombinantem humanem TNF. (A) Interaktionskurven (Sensogramme) von rekombinantem humanem TNF bei Konzentrationen von 50 nM–3 nM mit einem Sensorchip, auf dem der bispezifische A9-Antikörper und der Kontroll-tA9-Antikörper immobilisiert waren, sind gezeigt. Die Abszisse zeigt die Zeit in Sekunden, die Ordinate zeigt die Resonanzwinkelverschiebung in konventionellen Einheiten (AU). (B) Für jede Gruppe von Sensogrammen wurden die Bindungsrate (Op-Rate), die Dissoziationsrate (Off-Rate) und die Dissoziationskonstante (Kd) berechnet. Die resultierenden Mittelwerte sowie die Standardabweichung (SD) werden in einem Isoaffinitätsdiagramm aufgetragen. Die diagonalen Linien entsprechen den angegebenen Werten der Dissoziationskonstante.
Um die relative Aktivität des A9-Antikörpers bei der Hemmung der biologischen Wirkungen von TNF zu bewerten, wurde ein zytotoxischer Test an der L929-Maus-Fibrosarkom-Linie durchgeführt. Reihenverdünnungen von A9- und mA9-Antikörpern wurden zu konstanten Konzentrationen von rekombinantem humanem TNF und Actinomycin-D gegeben. Gemäß den erhaltenen Daten haben die Antikörper A9 und rA9 eine ähnliche AntiNF-Aktivität (Fig. 34A). Außerdem wurde bestätigt, dass die Aktivität des bispezifischen Antikörpers A9 der Aktivität des Einzeldomänen-Anti-NF-Antikörpers hTNF-VffH entspricht, der Teil von A9 und mA9 ist ( 34B ). 10 10 10
AntiNF-Aktivität des bispezifischen A9-Antikörpers, des mA9-Kontrollantikörpers und des hTNF-VffH-Einzeldomänen-Antikörpers. (A) Vergleich der Aktivität des bispezifischen A9-Antikörpers und des Kontroll-tA9-Antikörpers. Dargestellt ist die Überlebenskurve von L929-Maus-Fibrosarkomzellen bei gleichzeitiger Exposition gegenüber einer konstanten Dosis von humanem TNF und abnehmenden Dosen der Antikörper A9 und tA9. (B) Vergleich der Aktivität des bispezifischen A9-Antikörpers und des hTNF-VnH-Einzeldomänen-Antikörpers. Dargestellt ist die Überlebenskurve von L929-Maus-Fibrosarkomzellen bei gleichzeitiger Exposition gegenüber einer konstanten Dosis von humanem TNF und abnehmenden Dosen von A9- und hTNF-VHH-Antikörpern Der Vergleich wurde in molaren Konzentrationen durchgeführt, um den Einfluss von Molmassenunterschieden auszuschließen von der ermittelten Aktivität des Antikörpers.
Analyse der Bindung der Antikörper A9 und mA9 an die Oberfläche von Makrophagen durch Wechselwirkung mit dem Oberflächenmolekül F4/80.
Die Fähigkeit des bispezifischen A9-Antikörpers, spezifisch an die Oberfläche von Makrophagen zu binden, wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Dazu wurden aus der Bauchhöhle isolierte Zellen mit A9-Antikörpern inkubiert, anschließend auf die Makrophagenmarker CD1 1b und F4/80 gefärbt und gleichzeitig über Antikörper gegen VHH eine spezifische Färbung für den bispezifischen A9-Antikörper durchgeführt ODER Antikörper gegen die Polyhistidin-Markierung. Die Proben wurden dann einer Durchflusszytometrie und Analyse unterzogen.
Diese Experimente zeigten, dass der bispezifische A9-Antikörper in der Lage war, an die Oberfläche von Peritonealzellen zu binden, die F4/80 und CD1lb auf ihrer Oberfläche exprimieren (Monozyten und Makrophagen) ( 35A –D). Gleichzeitig bindet A9 nicht an Zellen der Bauchhöhle, die diese Marker nicht aufweisen (hauptsächlich Lymphozyten) (Abb. 35 E und F). Die Abnahme des Niveaus der parallelen Anti-F4/80-Färbung mit der Zugabe des A9-Antikörpers aufgrund der Konkurrenz zweier Antikörper um die Bindung an das Ziel bestätigt, dass A9 spezifisch mit diesem bestimmten Molekül auf der Zelloberfläche interagiert (Abb. 35 G und 3).
Auch der Name Mac-1 wird verwendet. Ein konstituierendes Element der C3-Rezeptorkomponente des Komplementsystems. Bei Mäusen wird es auf Monozyten, Makrophagen und Mikrogliazellen exprimiert. bispezifischer Antikörper
Zellen der Peritonealhöhle wurden mit oder ohne den bispezifischen A9-Antikörper (dargestellt in rot) oder ohne ihn (dargestellt in blau) inkubiert und dann mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker gefärbt, die für Monozyten-Makrophagen-Zellen spezifisch sind, sowie mit Antikörpern, die spezifisch sind bis A9. Anschließend wurden die erhaltenen Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. (A, C, E, G) Färbung durch Antikörper gegen die VHH-Domäne. (B, D, F, 3) Färbung durch Antikörper gegen die Polyhexidinsequenz. (A, B) Der bispezifische A9-Antikörper bindet an Zellen, die für eine hohe F4/80- und CD1-lb-Expression ausgewählt wurden (Makrophagen). Auf dem angezeigten Histogramm zeigt die horizontale Achse den Fluoreszenzwert im Färbekanal bei A9, die vertikale Achse zeigt die normalisierte Häufigkeit des Auftretens des Ereignisses. (C, D) das gleiche in Form eines Streuhistogramms. Die horizontale Achse zeigt den Fluoreszenzwert im Färbekanal bei A9, die vertikale Achse zeigt den Fluoreszenzwert im Färbekanal bei F4/80. (E, E)-bispezifischer Antikörper A9 bindet nicht an Zellen der Bauchhöhle, die F4/80 und CD1lb (Lymphozyten) nicht exprimieren. Auf dem angezeigten Histogramm zeigt die horizontale Achse den Fluoreszenzwert im Färbekanal bei A9, die vertikale Achse zeigt die normalisierte Häufigkeit des Auftretens des Ereignisses. (G, 3) -Inkubation mit dem bispezifischen A9-Antikörper reduziert die Färbeintensität um F4/80. Auf dem abgebildeten Histogramm zeigt die horizontale Achse den Fluoreszenzwert im Färbekanal bei F4/80, die vertikale Achse zeigt die normalisierte Häufigkeit des Auftretens des Ereignisses.
Knochenmarkmakrophagen wurden mit dem bispezifischen A9-Antikörper (rot dargestellt), ohne ihn (blau dargestellt) oder mit dem Kontroll-tA9-Antikörper (schwarz dargestellt) inkubiert und dann mit Antikörpern gefärbt, die für A9/mA9 spezifisch sind. Die erhaltenen Proben wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. (A) A9 bispezifischer Antikörper bindet spezifisch an Knochenmarkmakrophagen. Auf dem angezeigten Histogramm zeigt die horizontale Achse den Fluoreszenzwert im Färbekanal bei A9, die vertikale Achse zeigt die normalisierte Häufigkeit des Auftretens des Ereignisses. (B) Der mA9-Kontrollantikörper ist nicht in der Lage, an Knochenmarkmakrophagen zu binden. Auf dem angezeigten Histogramm zeigt die horizontale Achse den Wert der Fluoreszenz im Färbekanal auf wA9, die vertikale Achse zeigt die normalisierte Häufigkeit des Auftretens des Ereignisses.
Darüber hinaus wurde in zusätzlichen zytofluorometrischen Experimenten gezeigt, dass der A9-Antikörper, wenn er an die Oberfläche von Makrophagen gebunden ist, in der Lage ist, gleichzeitig exogen hinzugefügtes menschliches TNF zu binden ( 37 ). Dies bestätigt, dass beide Untereinheiten des bispezifischen Antikörpers gleichzeitig funktionell aktiv sind und dass eine gleichzeitige Bindung der beiden Antigene sterisch möglich ist.
Zellen der Peritonealhöhle wurden mit oder ohne bispezifischem A9-Antikörper (rot dargestellt) oder ohne (blau dargestellt) und dann mit rekombinantem humanem TNF inkubiert, wonach sie mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen für Monozyten-Makrophagen spezifische Oberflächenmarker gefärbt wurden Zellen sowie für humanes TNF spezifische Antikörper. Die erhaltenen Proben wurden durch Durchflusszytometrie analysiert. (A) Bispezifischer A9-Antikörper, der in der Lage ist, menschlichen TNF auf der Oberfläche von Makrophagen zu halten (Zellen, die für eine hohe Expression von F4/80 und CD1lb ausgewählt wurden). Auf dem angezeigten Histogramm zeigt die horizontale Achse den Fluoreszenzwert im TNF-Färbekanal, die vertikale Achse zeigt die normalisierte Häufigkeit des Auftretens des Ereignisses. (B) Dieselben Daten in Streuhistogrammform. Die horizontale Achse zeigt die Fluoreszenzwerte im TNF-Färbekanal, die vertikale Achse zeigt die Fluoreszenzwerte im F4/80-Färbekanal.
PROTEIN ENGINEERING, ein Zweig der Molekularbiologie und des Bioengineering, zu dessen Aufgaben die gezielte Veränderung der Struktur natürlicher Proteine und die Herstellung neuer Proteine mit gewünschten Eigenschaften gehören. Protein Engineering entstand in den frühen 1980er Jahren, als gentechnische Methoden entwickelt wurden, die es ermöglichten, verschiedene natürliche Proteine mit Hilfe von Bakterien oder Hefen zu gewinnen sowie die Struktur von Genen und damit die Aminosäuresequenz ( Primärstruktur) der Proteine, für die sie kodieren. Basierend auf den Organisationsprinzipien von Proteinmolekülen, dem Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion von Proteinen, schafft Protein Engineering eine wissenschaftlich fundierte Technologie zur gezielten Veränderung ihrer Struktur. Mit Hilfe des Protein Engineering ist es möglich, die thermische Stabilität von Proteinen zu erhöhen, ihre Resistenz gegenüber denaturierenden Effekten, organischen Lösungsmitteln und ihre Ligandenbindungseigenschaften zu verändern. Protein-Engineering ermöglicht durch den Austausch von Aminosäuren, die Funktion von Enzymen und ihre Spezifität zu verbessern, die optimalen pH-Werte, bei denen das Enzym arbeitet, zu ändern, unerwünschte Nebenaktivitäten zu eliminieren, Molekülregionen zu eliminieren, die enzymatische Reaktionen hemmen, die Wirksamkeit von Proteinen zu erhöhen Drogen und so weiter. Beispielsweise ermöglichte der Ersatz von nur einem Threonin-Rest durch einen Alanin- oder Prolin-Rest eine 50-fache Steigerung der Aktivität des Tyrosyl-tRNA-Synthetase-Enzyms, und durch den Ersatz von 8 Aminosäure-Resten, dem sogenannten Thermolysin- wie die Protease aus Bacillus stearothermophilus die Fähigkeit erlangte, die Aktivität mehrere Stunden bei 120 °C aufrechtzuerhalten. Protein-Engineering umfasst auch Arbeiten zur gezielten Veränderung der Eigenschaften von Proteinen durch chemische Modifikationen, beispielsweise das Einbringen von photoaktivierbaren Verbindungen, die die Eigenschaften eines Moleküls unter Lichteinwirkung verändern, Markierungsverbindungen, die es ermöglichen, die Wege eines Proteins nachzuvollziehen Protein in einer Zelle oder lenken es zu verschiedenen Komponenten einer Zelle und ähnliches. Diese Arbeiten werden hauptsächlich an gentechnologisch gewonnenen rekombinanten Proteinen durchgeführt.
Beim Protein-Engineering lassen sich zwei Richtungen unterscheiden: rationales Design und gerichtete molekulare Evolution von Proteinen. Die erste beinhaltet die Nutzung von Informationen über die strukturell-funktionellen Beziehungen in Proteinen, die mit physikalisch-chemischen und biologischen Methoden sowie Computer Molecular Modelling gewonnen wurden, um zu bestimmen, welche Änderungen in der Primärstruktur zum gewünschten Ergebnis führen sollen. Um die thermische Stabilität eines Proteins zu erhöhen, ist es also notwendig, seine räumliche Struktur zu bestimmen, "schwache" Bereiche zu identifizieren (z. B. Aminosäuren, die nicht stark mit ihrer Umgebung verbunden sind) und die besten Optionen für den Ersatz anderer Aminosäuren auszuwählen Säuren unter Verwendung von molekularer Modellierung und Optimierung der Energieparameter des Moleküls; mutieren Sie danach das entsprechende Gen und erhalten und analysieren Sie dann das mutierte Protein. Wenn dieses Protein die angegebenen Parameter nicht erfüllt, führen Sie eine neue Analyse durch und wiederholen Sie den beschriebenen Zyklus. Dieser Ansatz wird am häufigsten bei der Konstruktion künstlicher Proteine (De-novo-Proteine) mit gewünschten Eigenschaften verwendet, wenn der Input eine neue Aminosäuresequenz ist, die größtenteils oder vollständig von einem Menschen spezifiziert wird, und der Output ein Proteinmolekül mit den gewünschten Eigenschaften ist Eigenschaften. Bisher lassen sich auf diese Weise jedoch nur kleine De-novo-Proteine mit einfacher räumlicher Struktur erhalten, in die einfache funktionelle Aktivitäten eingeführt werden können, beispielsweise Metallbindungsstellen oder kurze Peptidfragmente, die beliebige biologische Funktionen tragen.
Bei der gerichteten molekularen Evolution von Proteinen wird durch gentechnische Methoden ein großer Satz verschiedener mutierter Gene des Zielproteins gewonnen, die dann in besonderer Weise, insbesondere auf der Oberfläche von Phagen („Phage Display“) oder in exprimiert werden Bakterienzellen, um Mutanten mit den besten Eigenschaften selektieren zu können. Dazu werden beispielsweise die Gene des gewünschten Proteins oder seiner Teile in das Genom des Phagen integriert – in die auf der Oberfläche des Phagenpartikels befindliche Zusammensetzung des für das Protein kodierenden Gens. Gleichzeitig trägt jeder einzelne Phage sein eigenes mutiertes Protein, das bestimmte Eigenschaften hat, nach denen selektiert wird. Mutierte Gene werden durch "Mischen" einer Reihe von Genen aus ähnlichen natürlichen Proteinen aus verschiedenen Organismen hergestellt, normalerweise unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktionsmethode, so dass jedes resultierende mutierte Protein Fragmente vieler der "Eltern"-Proteine enthalten kann. Im Wesentlichen ahmt dieser Ansatz die natürliche Evolution von Proteinen nach, jedoch nur in einem viel schnelleren Tempo. Die Hauptaufgabe eines Proteiningenieurs besteht in diesem Fall darin, ein effektives Selektionssystem zu entwickeln, das die Auswahl der besten mutierten Proteinvarianten mit den gewünschten Parametern ermöglicht. Im Fall der obigen Aufgabe – Erhöhung der thermischen Stabilität des Proteins – kann die Selektion beispielsweise durchgeführt werden, indem Zellen, die mutierte Gene enthalten, bei einer erhöhten Temperatur gezüchtet werden (vorausgesetzt, dass das Vorhandensein eines mutierten Proteins in der Zelle dessen erhöht thermische Stabilität).
Beide Bereiche des Protein Engineering haben das gleiche Ziel und ergänzen sich gegenseitig. Die Untersuchung mutanter Proteinvarianten, die mit Methoden der molekularen Evolution gewonnen wurden, ermöglicht es daher, die strukturelle und funktionelle Organisation von Proteinmolekülen besser zu verstehen und die gewonnenen Erkenntnisse für ein gezieltes rationales Design neuer Proteine zu nutzen. Die Weiterentwicklung des Protein Engineering ermöglicht die Lösung vieler praktischer Probleme der Verbesserung natürlicher und der Gewinnung neuer Proteine für die Bedürfnisse der Medizin, Landwirtschaft und Biotechnologie. In Zukunft ist es möglich, Proteine mit in der Natur unbekannten Funktionen herzustellen.
Lit.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. 20 Jahre Protein-Engineering // Nature Reviews. Molekulare Zellbiologie. 2002 Vol. 3. Nr. 12; Patrushev L. I. Künstliche genetische Systeme. M., 2004. Vol. 1: Gen- und Protein-Engineering.
