Autorádiografia. Rádioautografia Metóda autorádiografie v cytológii
Autorádiografia autorádiografia, rádioautografia, metóda na štúdium distribúcie rádioaktívnych látok v skúmanom objekte nanesením fotografickej emulzie citlivej na rádioaktívne žiarenie na objekt. Rádioaktívne látky obsiahnuté v objekte akoby fotografovali samé seba (odtiaľ názov). Metóda A. je široko používaná vo fyzike a technike, v biológii a medicíne - všade tam, kde sa používajú izotopové indikátory. Po vyvolaní a zafixovaní fotografickej emulzie sa na nej získa obrázok, ktorý zobrazuje študovanú distribúciu. Fotografickú emulziu môžete na objekt naniesť niekoľkými spôsobmi. Na vyleštený povrch vzorky možno priamo naniesť fotografickú platňu alebo na vzorku naniesť teplú tekutú emulziu, ktorá po stuhnutí vytvorí vrstvu tesne priliehajúcu k vzorke a po expozícii a spracovaní fotografie sa skúma. Distribúcia rádioaktívnych látok sa študuje porovnaním hustoty sčernenia filmu z testovanej a referenčnej vzorky (tzv. makrorádiografia). Druhá metóda spočíva v počítaní stôp vytvorených ionizáciou častíc vo fotografickej emulzii pomocou optického alebo elektrónového mikroskopu (mikrorádiografia). Táto metóda je oveľa citlivejšia ako prvá. Na získanie makroautogramov sa používajú transparentné a röntgenové emulzie, na mikroautografy špeciálne jemnozrnné emulzie. Fotografický obraz distribúcie rádioaktívnych látok v skúmanom objekte, získaný A. metódou, sa nazýva autorádiogram alebo rádioautograf. Na ryža. 12
a 3
sú uvedené príklady autorádiogramov. Metódou A. možno zistiť prítomnosť rádioaktívnych prvkov v rôznych rudách, distribúciu prirodzených rádioaktívnych prvkov v tkanivách rastlinných a živočíšnych organizmov a pod. Zavedenie zlúčenín značených rádioizotopmi do tela a ďalšie skúmanie tkanív a buniek metódou A. umožňuje získať presné údaje o konkrétnych bunkách alebo bunkových štruktúrach, v ktorých prebiehajú určité procesy, lokalizované určité látky a stanoviť časové parametre množstva procesov. Takže napríklad použitie rádioaktívneho fosforu a A. umožnilo zistiť prítomnosť intenzívneho metabolizmu v rastúcej kosti; použitie rádiojódu a A. umožnilo objasniť vzorce činnosti štítnej žľazy; zavedenie značených zlúčenín – prekurzorov bielkovín a nukleových kyselín a A. pomohlo pochopiť úlohu určitých bunkových štruktúr pri výmene týchto životne dôležitých zlúčenín. Metóda A. umožňuje určiť nielen lokalizáciu rádioizotopu v biologickom objekte, ale aj jeho množstvo, keďže počet redukovaných zŕn striebra v emulzii je úmerný počtu častíc, ktoré naň pôsobia. Kvantitatívna analýza makroautografov sa vykonáva obvyklými metódami fotometrie (pozri Fotometria) ,
a mikroautografy - počítaním pod mikroskopom strieborných zŕn alebo stôp, ktoré vznikli v emulzii pôsobením ionizujúcich častíc. A. začnú úspešne kombinovať s elektrónovou mikroskopiou (Pozri Elektrónová mikroskopia). Pozri tiež Rádiografia. Lit.: Boyd D. A. Autorádiografia v biológii a medicíne, prekl. z angličtiny, M., 1957; Zhinkin L. N., Použitie rádioaktívnych izotopov v histológii, v knihe: Radiotracers in histology, L., 1959, s. 5-33; Perry R., Kvantitatívna autorádiografia, Methods in Cell Physiology, 1964, v. Ja, ch. 15, str. 305-26. N. G. Chruščov. Ryža. 2. Autorádiogram (tlač) zobrazujúci distribúciu fosforu (32 P) v listoch rajčiaka. Rastlina bola predtým umiestnená do roztoku obsahujúceho rádioaktívny fosfor. Svetlé oblasti zodpovedajú zvýšeným koncentráciám rádioaktívneho izotopu; je vidieť, že fosfor je koncentrovaný na stonke a v cievnych častiach listov. Ryža. 1. Mikrorádiogram vzorky niklu. Študuje sa difúzia cínu označeného rádioaktívnym izotopom 113Sn v nikle. Distribúcia rádioaktívneho cínu ukazuje, že k difúzii dochádza hlavne pozdĺž hraníc zŕn niklu.
Veľká sovietska encyklopédia. - M.: Sovietska encyklopédia. 1969-1978 .
Synonymá:Pozrite sa, čo je "Autorádiografia" v iných slovníkoch:
- (z auto ... a rádiografie) spôsob zaznamenávania distribúcie rádioaktívnych látok v objekte. Na povrch (rez) sa nanesie fólia s emulziou citlivou na žiarenie. Rádioaktívne látky sa akoby fotia ... ... Veľký encyklopedický slovník
- (rádioautografia), metóda merania distribúcie rádioakt. c c v skúmanom objekte (podľa vlastného žiarenia), spočívajúce v nanesení vrstvy jadrovej fotografickej emulzie naň. Distribúcia je určená hustotou vyvinutého sčernenia ... ... Fyzická encyklopédia
Metóda na štúdium distribúcie rádioaktívnych látok (izotopov) v skúmanom objekte alebo zlúčeninách. Spočíva v tom, že sa na predmet (alebo napríklad chromatogram) nanesie fotografická emulzia citlivá na rádioaktívne žiarenie a získa sa odtlačok, ... ... Mikrobiologický slovník
Exist., počet synoným: 4 autorádiografia (2) makroautorádiografia (1) ... Slovník synonym
Autorádiografia. Pozri rádioautogram. (Zdroj: "Anglický ruský vysvetľujúci slovník genetických pojmov". Arefiev V.A., Lisovenko L.A., Moskva: Vydavateľstvo VNIRO, 1995) ... Molekulárna biológia a genetika. Slovník.
autorádiografia- Metóda štúdia distribúcie rádioaktu. zložky v skúmanej vzorke vlastným žiarením aplikovaním na vzorku citlivú na rádioaktívny akt. emulzné žiarenie. Distribúcia je určená hustotou vyvinutého sčernenia ... ... Technická príručka prekladateľa
Autorádiografia- * autorádiografia * autorádiografia pozri ... genetika. encyklopedický slovník
- (z auto ... a rádiografie), spôsob zaznamenávania distribúcie rádioaktívnych látok v objekte. Na povrch (rez) sa nanesie fólia s emulziou citlivou na žiarenie. Rádioaktívne látky sa akoby fotia ... ... encyklopedický slovník
knihy
- Autorádiografia v biológii a medicíne, J. Boyd, Kniha patrí k jedným z tvorcov metódy autorádiografie. Prvých osem kapitol je venovaných teórii otázky. Zvažujú teóriu fotografického procesu, vlastnosti a vlastnosti ... Kategória: Základy medicínskych vedomostí Vydavateľ:
Rádiová autografia je relatívne nová metóda, ktorá nesmierne rozšírila možnosti svetelnej aj elektrónovej mikroskopie. Ide o vysoko modernú metódu, vďaka rozvoju jadrovej fyziky, ktorá umožnila získať rádioaktívne izotopy rôznych prvkov. Pre rádioautografiu ide najmä o izotopy tých prvkov, ktoré bunka využíva alebo sa môžu viazať na látky používané bunkou, a ktoré možno podávať zvieratám alebo pridávať do kultúr v množstvách, ktoré nenarúšajú normálny bunkový metabolizmus. Keďže rádioaktívny izotop (alebo ním označená látka) sa zúčastňuje biochemických reakcií rovnako ako jeho nerádioaktívny náprotivok a zároveň vyžaruje žiarenie, dráhu izotopov v tele možno sledovať pomocou rôznych metód detekcie. rádioaktivita. Jeden spôsob detekcie rádioaktivity je založený na jej schopnosti pôsobiť na fotografický film ako svetlo; ale rádioaktívne žiarenie preniká čiernym papierom používaným na ochranu filmu pred svetlom a má na film rovnaký účinok ako svetlo.
Aby bolo možné detekovať žiarenie vyžarované rádioaktívnymi izotopmi na prípravkoch určených na štúdium pomocou svetelných alebo elektrónových mikroskopov, prikryjú sa prípravky v tmavej miestnosti špeciálnou fotografickou emulziou, po ktorej sa nechajú nejaký čas v tme. Potom sa sklíčka vyvolávajú (aj v tme) a fixujú. Oblasti liečiva obsahujúce rádioaktívne izotopy ovplyvňujú emulziu ležiacu nad nimi, v ktorej sa pod pôsobením emitovaného žiarenia objavujú tmavé "zrnká". Dostávajú teda rádiové autogramy (z gréčtiny. rádio- žiarivý autá- seba a grafo- písať).
Najprv mali histológovia len niekoľko rádioaktívnych izotopov; napríklad mnohé z prvých štúdií využívajúcich autorádiografiu používali rádioaktívny fosfor. Neskôr sa použilo oveľa viac týchto izotopov; Rádioaktívny izotop vodíka, trícium, našiel obzvlášť široké využitie.
Autorádiografia bola a stále je veľmi široko používaná na štúdium toho, kde a ako prebiehajú určité biochemické reakcie v tele.
Chemické zlúčeniny označené rádioaktívnymi izotopmi, ktoré sa používajú na štúdium biologických procesov, sa nazývajú prekurzory. Prekurzory sú zvyčajne látky podobné tým, ktoré telo prijíma z potravy; slúžia ako stavebné kamene pre stavbu tkanív a sú začlenené do komplexných zložiek buniek a tkanív rovnakým spôsobom, akým sa do nich začleňujú neoznačené stavebné bloky. Tkanivová zložka, do ktorej je začlenený označený prekurzor a ktorá emituje žiarenie, sa nazýva produkt.
Bunky pestované v kultúre, hoci sú rovnakého typu, budú v akomkoľvek danom čase v rôznych štádiách bunkového cyklu, pokiaľ sa nevenuje zvláštna pozornosť synchronizácii ich cyklov. Avšak injekciou trícium-tymidínu do buniek a následným vyhotovením autogramov je možné určiť trvanie rôznych štádií cyklu. Čas nástupu jedného štádia – mitózy – možno určiť bez značeného tymidínu. Za týmto účelom sa vzorka buniek z kultúry udržiava pod pozorovaním v mikroskope s fázovým kontrastom, ktorý umožňuje priamo sledovať priebeh mitózy a nastaviť jej načasovanie. Trvanie mitózy je zvyčajne 1 hodina, hoci u niektorých typov buniek to trvá až 1,5 hodiny.
Metóda rádiovej autografie
Rádiová autografia, definícia, história.
Metóda autorádiografie je založená na zavedení zlúčeniny „označenej“ rádioaktívnym atómom do skúmaného objektu a identifikácii miesta jej zaradenia pomocou fotografickej registrácie žiarenia. Základom pre získanie obrazu je vplyv ionizujúcich častíc vznikajúcich pri rozpade rádioaktívneho atómu na jadrovú fotografickú emulziu obsahujúcu kryštály halogenidu striebra.
Objav metódy autorádiografie priamo súvisí s objavom fenoménu rádioaktivity. V roku 1867 bolo publikované prvé pozorovanie o vplyve uránových solí na halogenidy striebra (Niepce de St.Victor). V roku 1896 Henry Becquerel pozoroval osvetlenie fotografickej dosky soľami uránu bez predchádzajúceho vystavenia svetlu. Tento experiment sa považuje za moment objavenia fenoménu rádioaktivity. Autorádiografiu aplikovanú na biologický materiál prvýkrát použili Lacassagne a Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) v 20. rokoch 20. storočia; histologický blok z rôznych orgánov zvierat po zavedení izotopov bol pritlačený svojou plochou stranou k röntgenovej platni a exponovaný. Histologický rez bol pripravený vopred a podrobený štandardnému postupu farbenia. Výsledný autogram bol študovaný oddelene od rezu. Táto metóda umožňuje odhadnúť intenzitu inkorporácie izotopu do biologickej vzorky. V 40. rokoch 20. storočia Leblond použil autorádiografiu na preukázanie distribúcie izotopu jódu v častiach štítnej žľazy (Leblond C.P. 1943).
Prvé pokusy spojiť autorádiografiu s elektrónovou mikroskopiou sa uskutočnili v 50. rokoch 20. storočia (Liquir-Milward, 1956). Elektrónová mikroskopická autorádiografia je špeciálnym prípadom konvenčnej autorádiografie, pri ktorej sa počítajú aj zrnká striebra a zohľadňuje sa ich distribúcia. Zvláštnosťou metódy je použitie veľmi tenkej vrstvy emulzie. V súčasnosti sa dosiahlo rozlíšenie okolo 50 nm, čo je 10-20 krát vyššie ako pri svetelnej mikroskopii.
V súčasnosti je metóda autorádiografie doplnená o možnosť automatického odhadu počtu zŕn striebra pomocou videoanalyzátorov. Na zosilnenie signálu tagu (spravidla ide o vysokoenergetické izotopy) sa často používajú rôzne typy scintilátorov, ktoré sa nanášajú na platne (zosilňovacie sito potiahnuté fosforom), alebo sa impregnujú do emulzie (PPO) - v tomto prípade emisia fotónov osvetľuje konvenčnú fotografickú platňu alebo film.
Fotografický princíp získania obrazu, fotografická emulzia
V rádiografickej štúdii plní úlohu detektora jadrového rozpadu fotografická emulzia, v ktorej pri prechode ionizujúcej častice zostáva latentný obraz, ktorý sa potom odhalí pri vyvolávaní, podobne ako pri spracovaní bežného fotografického filmu.
Fotoemulzia je suspenzia mikrokryštálov halogenidu striebra v želatíne. Mikrokryštály majú štrukturálne defekty nazývané centrá citlivosti. Podľa Gurneyho-Mottovho modelu sú tieto poruchy v iónovej mriežke kryštálu schopné zachytiť elektróny uvoľnené pri prechode častice alfa alebo beta cez vodivý pás kryštálu, v dôsledku čoho sa ión premení na atóm. . Výsledný latentný obraz možno odhaliť postupom, ktorý premieňa aktivované kryštály halogenidu striebra na zrná kovového striebra (tento proces sa nazýva chemický vývoj). Ako vývojku je možné použiť akékoľvek činidlo s dostatočnou redukčnou aktivitou (vo fotografii a autorádiografii sa zvyčajne používa metol, amidol alebo hydrochinón). Po expozícii exponovaných kryštálov sa zvyšné mikrokryštály halogenidu striebra odstránia z emulzie fixačným prostriedkom (zvyčajne hyposulfitom). Jadrové fotografické emulzie sa vyznačujú rozlíšením (zrno) a citlivosťou. Prvá je určená veľkosťou mikrokryštálov striebornej soli a je nepriamo úmerná druhej. Fotografická emulzia sa vyznačuje zníženou citlivosťou na viditeľné svetlo, no prácu s ňou však treba robiť v tme, aby sa vylúčil výskyt artefaktov.
Emulziu možno na liečivo naniesť vo forme hotového filmu so substrátom alebo ponorením liečiva do zohriatej tekutej emulzie – získa sa tak tenká rovnomerná vrstva, ktorá sa vyvolá bežným spôsobom. Pred aplikáciou emulzie na svetelnú mikroskopiu sa sklíčko zvyčajne zafarbí požadovaným histologickým farbivom, ale bledším ako zvyčajne, aby sa umožnilo počítanie strieborných zŕn vo všetkých oblastiach. Droga je vystavená určitý čas, potom sa vyvinie.
Izotopy používané v autorádiografii.
V autorádiografii sa v závislosti od cieľov štúdie a dostupných materiálov môžu použiť rôzne izotopy. Obraz vytvorený ionizujúcou časticou na jadrovej fotografickej emulzii závisí od energie častice a typu jej interakcie s hmotou.
Častice alfa emitované identickými rádioaktívnymi jadrami majú rovnakú energiu ( E) a rovnakú dĺžku cesty ( R) , spojené nasledujúcim vzťahom:
R = kE3/2
Kde k – konštanta charakterizujúca prostredie, v ktorom sa častice šíria. Rozsah častíc v srdci je určený jeho hustotou a elementárnym zložením. Bragg-Klymenov vzťah umožňuje odhadnúť rozsah v látke s atómovou hmotnosťou A a hustotou podľa rozsahu alfa častíc vo vzduchu (R0) d:
R= 0,0003 (R0 / d) A1/2
Pretože ionizačná sila častíc alfa je veľmi vysoká, uľahčuje to fotografickú registráciu distribúcie izotopov a tiež umožňuje použitie neemulzných materiálov na registráciu. Stopa častíc alfa vyžarovaných jedným zdrojom na autogramoch vyzerá ako lúč rovných segmentov, zvyčajne dlhých 15-50 mikrónov, vychádzajúcich z jedného bodu, čo vám umožňuje presne lokalizovať miesto zahrnutia rádioaktívnej značky. Alfa častice sú však emitované izotopmi s veľkými atómovými číslami, čo obmedzuje ich použitie ako biologickej značky.
Stopy častíc alfa sa často pozorujú na histologických rádiografoch ako artefakt - výsledok samovyžarovania izotopov na podložnom sklíčku.
Beta žiarenie je charakterizované spojitým spektrom počiatočnej energie častíc – od nuly po E max určenú pre každý izotop. Tvary spektra sa výrazne líšia. Najpravdepodobnejšia energia častíc emitovaných tritemom je teda 1/7 E max, 14C - asi ¼, 32P - asi 1/3. Maximálna energia beta žiarenia rôznych izotopov sa pohybuje od 18 keV do 3,5 MeV – v oveľa širšom rozsahu ako alfa žiarenie. Maximálna energia je spravidla vyššia pre izotopy s krátkou životnosťou.
Prechod beta častíc a monoenergetických elektrónov hmotou sprevádzajú dva hlavné typy interakcie. Pri interakcii s obiehajúcim elektrónom mu častica môže odovzdať energiu dostatočnú na ionizáciu atómu (odstránenie elektrónu z obežnej dráhy). V zriedkavých prípadoch je táto energia taká vysoká, že je možné pozorovať dráhu uvoľneného elektrónu. V dôsledku rovnosti hmotností častice a elektrónu dochádza k odchýlke od počiatočného pohybu. Interakcia druhého typu s atómovými jadrami vedie k vzniku brzdného röntgenového žiarenia. Aj keď to emulzia nezaregistruje, akt interakcie častice s jadrom môže byť detegovaný ostrým zlomom v trajektórii.
Opakovaná interakcia s obiehajúcimi elektrónmi vedie k zakriveniu trajektórie, ktorá zvyčajne vyzerá ako vinutá čiara, najmä v záverečnej časti, keď sa rýchlosť častice zníži a ionizačný výkon sa zvýši. Dĺžka trajektórie citeľne presahuje vzdialenosť od štartu do koncového bodu trate – behu. Z tohto dôvodu sa aj monoenergetické elektróny vyznačujú prítomnosťou rozsahu rozsahov ohraničených zhora R max, ktorý je typický pre toto žiarenie. Kvôli nižším stratám ionizácie sa beta častice detegujú ťažšie ako častice alfa. Netvoria súvislé stopy (okrem najjemnejšieho žiarenia trícia - v tomto prípade je však pravdepodobnosť prechodu cez viac ako jeden kryštál emulzie malá), hustota a počet vyvinutých kryštálov sa mení v rôznych medziach. Rozsah beta častice v inom prvku možno odhadnúť zo vzorca:
R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)
V širokom rozsahu hodnôt E max maximálny počet najazdených kilometrov súvisí s maximálnou energiou podľa vzťahu:
R m= 412 E max 1,265 – 0,0954 lnE max
Rozdiel v rozsahoch, ionizačnej schopnosti a hustote vyvinutých emulzných kryštálov pre častice s rôznymi energiami možno použiť na rozlíšenie distribúcie prvkov, ak sa ich izotopy výrazne líšia v E max, ako v prípade trícia a 14C. Diskriminácia distribúcie dvoch izotopov sa uskutočňuje nanesením dvoch emulzných vrstiev na vzorku, prvá vrstva registruje prevažne mäkké žiarenie, druhá - tvrdé. Podľa niektorých prác sa dajú z veľkosti kryštálov vyvinutej emulzie spoľahlivo oddeliť rôzne izotopy - kryštály ovplyvnené beta časticou trícia, ktorá má vyššiu ionizačnú silu, sú väčšie.
Vnútorné konverzné elektróny vznikajú, keď je absorbované gama kvantum s veľmi nízkou energiou žiarenia a elektrón je odstránený z vnútorného obalu atómu. Tieto elektróny sú podobné mäkkým časticiam beta, ale na rozdiel od nich sú monoenergetické. Prítomnosť vnútorných konverzných elektrónov umožňuje použitie izotopov, ako je 125I.
V súčasnosti sú najčastejšie používané izotopy emitujúce beta častice. Trícium sa spravidla používa na značenie v histologických štúdiách. Prvé autogramy s použitím trícia boli vyrobené už v 50. rokoch 20. storočia (Fitzgerald et al. 1951), ale jeho široké používanie sa začalo po získaní tymidínu označeného tríciom v laboratóriu v Brookhaven. Keďže vodík je súčasťou všetkých organických látok, pomocou trícia môžete získať rôzne zlúčeniny, ktoré nesú rádioaktívnu značku. Čím nižšia je energia emitovanej častice, tým kratšiu stopu zanecháva pri pohybe vo fotografickej emulzii a tým presnejšie je možné lokalizovať polohu označeného atómu. Dĺžka dráhy častíc trícia beta je cca 1-2 μm, najpravdepodobnejšia energia je 0,005 MeV a dráha pozostáva vo väčšine prípadov z jediného strieborného zrna, čo umožňuje lokalizovať zdroj žiarenia nielen v relatívne veľkých bunkových štruktúr, ako je jadro, ale aj v jednotlivých chromozómoch.
Zavedenie „značených“ metabolitov do tela umožňuje sledovať inkorporáciu izotopu do buniek živočíšnych tkanív, čo umožňuje študovať rôzne biochemické procesy v živom organizme.
Získanie absolútnych údajov - koncentrácia značenej látky v skúmanom objekte je málokedy cieľom rádioautografického výskumu, na to je potrebné poznať množstvo podmienok, ktorých určenie je náročné. Preto sa kvantitatívne rádioautografické štúdie zvyčajne uskutočňujú porovnaním koncentrácie zŕn striebra nad testovaným objektom a kontrolou, pričom kontrolné údaje sa bežne berú ako jedna alebo 100 %.
Charakteristika niektorých použitých izotopov
v rádioautografii biologických objektov
Metóda rádiovej autografie
Rádiová autografia, definícia, história.
Metóda autorádiografie je založená na zavedení zlúčeniny „označenej“ rádioaktívnym atómom do skúmaného objektu a identifikácii miesta jej zaradenia pomocou fotografickej registrácie žiarenia. Základom pre získanie obrazu je vplyv ionizujúcich častíc vznikajúcich pri rozpade rádioaktívneho atómu na jadrovú fotografickú emulziu obsahujúcu kryštály halogenidu striebra.
Objav metódy autorádiografie priamo súvisí s objavom fenoménu rádioaktivity. V roku 1867 bolo publikované prvé pozorovanie o vplyve uránových solí na halogenidy striebra (Niepce de St.Victor). V roku 1896 Henry Becquerel pozoroval osvetlenie fotografickej dosky soľami uránu bez predchádzajúceho vystavenia svetlu. Tento experiment sa považuje za moment objavenia fenoménu rádioaktivity. Autorádiografiu aplikovanú na biologický materiál prvýkrát použili Lacassagne a Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) v 20. rokoch 20. storočia; histologický blok z rôznych orgánov zvierat po zavedení izotopov bol pritlačený svojou plochou stranou k röntgenovej platni a exponovaný. Histologický rez bol pripravený vopred a podrobený štandardnému postupu farbenia. Výsledný autogram bol študovaný oddelene od rezu. Táto metóda umožňuje odhadnúť intenzitu inkorporácie izotopu do biologickej vzorky. V 40. rokoch 20. storočia Leblond použil autorádiografiu na preukázanie distribúcie izotopu jódu v častiach štítnej žľazy (Leblond C.P. 1943).
Prvé pokusy spojiť autorádiografiu s elektrónovou mikroskopiou sa uskutočnili v 50. rokoch 20. storočia (Liquir-Milward, 1956). Elektrónová mikroskopická autorádiografia je špeciálnym prípadom konvenčnej autorádiografie, pri ktorej sa počítajú aj zrnká striebra a zohľadňuje sa ich distribúcia. Zvláštnosťou metódy je použitie veľmi tenkej vrstvy emulzie. V súčasnosti sa dosiahlo rozlíšenie okolo 50 nm, čo je 10-20 krát vyššie ako pri svetelnej mikroskopii.
V súčasnosti je metóda autorádiografie doplnená o možnosť automatického odhadu počtu zŕn striebra pomocou videoanalyzátorov. Na zosilnenie signálu tagu (spravidla ide o vysokoenergetické izotopy) sa často používajú rôzne typy scintilátorov, ktoré sa nanášajú na platne (zosilňovacie sito potiahnuté fosforom), alebo sa impregnujú do emulzie (PPO) - v tomto prípade emisia fotónov osvetľuje konvenčnú fotografickú platňu alebo film.
Fotografický princíp získania obrazu, fotografická emulzia
V rádiografickej štúdii plní úlohu detektora jadrového rozpadu fotografická emulzia, v ktorej pri prechode ionizujúcej častice zostáva latentný obraz, ktorý sa potom odhalí pri vyvolávaní, podobne ako pri spracovaní bežného fotografického filmu.
Fotoemulzia je suspenzia mikrokryštálov halogenidu striebra v želatíne. Mikrokryštály majú štrukturálne defekty nazývané centrá citlivosti. Podľa Gurneyho-Mottovho modelu sú tieto poruchy v iónovej mriežke kryštálu schopné zachytiť elektróny uvoľnené pri prechode častice alfa alebo beta cez vodivý pás kryštálu, v dôsledku čoho sa ión premení na atóm. . Výsledný latentný obraz možno odhaliť postupom, ktorý premieňa aktivované kryštály halogenidu striebra na zrná kovového striebra (tento proces sa nazýva chemický vývoj). Ako vývojku je možné použiť akékoľvek činidlo s dostatočnou redukčnou aktivitou (vo fotografii a autorádiografii sa zvyčajne používa metol, amidol alebo hydrochinón). Po expozícii exponovaných kryštálov sa zvyšné mikrokryštály halogenidu striebra odstránia z emulzie fixačným prostriedkom (zvyčajne hyposulfitom). Jadrové fotografické emulzie sa vyznačujú rozlíšením (zrno) a citlivosťou. Prvá je určená veľkosťou mikrokryštálov striebornej soli a je nepriamo úmerná druhej. Fotografická emulzia sa vyznačuje zníženou citlivosťou na viditeľné svetlo, no prácu s ňou však treba robiť v tme, aby sa vylúčil výskyt artefaktov.
Emulziu možno na liečivo naniesť vo forme hotového filmu so substrátom alebo ponorením liečiva do zohriatej tekutej emulzie – získa sa tak tenká rovnomerná vrstva, ktorá sa vyvolá bežným spôsobom. Pred aplikáciou emulzie na svetelnú mikroskopiu sa sklíčko zvyčajne zafarbí požadovaným histologickým farbivom, ale bledším ako zvyčajne, aby sa umožnilo počítanie strieborných zŕn vo všetkých oblastiach. Droga je vystavená určitý čas, potom sa vyvinie.
Izotopy používané v autorádiografii.
V autorádiografii sa v závislosti od cieľov štúdie a dostupných materiálov môžu použiť rôzne izotopy. Obraz vytvorený ionizujúcou časticou na jadrovej fotografickej emulzii závisí od energie častice a typu jej interakcie s hmotou.
Častice alfa emitované identickými rádioaktívnymi jadrami majú rovnakú energiu ( E) a rovnakú dĺžku cesty ( R) , spojené nasledujúcim vzťahom:
R = kE 3/2
Kde k – konštanta charakterizujúca prostredie, v ktorom sa častice šíria. Rozsah častíc v srdci je určený jeho hustotou a elementárnym zložením. Braggov-Klymenov vzťah umožňuje pomocou rozsahu alfa častíc vo vzduchu (R 0) odhadnúť rozsah v látke s atómovou hmotnosťou A a hustotou d:
R= 0,0003 (R0 / d) A 1/2
Pretože ionizačná sila častíc alfa je veľmi vysoká, uľahčuje to fotografickú registráciu distribúcie izotopov a tiež umožňuje použitie neemulzných materiálov na registráciu. Stopa častíc alfa vyžarovaných jedným zdrojom na autogramoch vyzerá ako lúč rovných segmentov, zvyčajne dlhých 15-50 mikrónov, vychádzajúcich z jedného bodu, čo vám umožňuje presne lokalizovať miesto zahrnutia rádioaktívnej značky. Alfa častice sú však emitované izotopmi s veľkými atómovými číslami, čo obmedzuje ich použitie ako biologickej značky.
Stopy častíc alfa sa často pozorujú na histologických rádiografoch ako artefakt - výsledok samovyžarovania izotopov na podložnom sklíčku.
Prechod beta častíc a monoenergetických elektrónov hmotou sprevádzajú dva hlavné typy interakcie. Pri interakcii s obiehajúcim elektrónom mu častica môže odovzdať energiu dostatočnú na ionizáciu atómu (odstránenie elektrónu z obežnej dráhy). V zriedkavých prípadoch je táto energia taká vysoká, že je možné pozorovať dráhu uvoľneného elektrónu. V dôsledku rovnosti hmotností častice a elektrónu dochádza k odchýlke od počiatočného pohybu. Interakcia druhého typu s atómovými jadrami vedie k vzniku brzdného röntgenového žiarenia. Aj keď to emulzia nezaregistruje, akt interakcie častice s jadrom môže byť detegovaný ostrým zlomom v trajektórii.
Opakovaná interakcia s obiehajúcimi elektrónmi vedie k zakriveniu trajektórie, ktorá zvyčajne vyzerá ako vinutá čiara, najmä v záverečnej časti, keď sa rýchlosť častice zníži a ionizačný výkon sa zvýši. Dĺžka trajektórie citeľne presahuje vzdialenosť od štartu do koncového bodu trate – behu. Z tohto dôvodu sa aj monoenergetické elektróny vyznačujú prítomnosťou rozsahu rozsahov ohraničených zhora R max, ktorý je typický pre toto žiarenie. Kvôli nižším stratám ionizácie sa beta častice detegujú ťažšie ako častice alfa. Netvoria súvislé stopy (okrem najjemnejšieho žiarenia trícia - v tomto prípade je však pravdepodobnosť prechodu cez viac ako jeden kryštál emulzie malá), hustota a počet vyvinutých kryštálov sa mení v rôznych medziach. Rozsah beta častice v inom prvku možno odhadnúť zo vzorca:
R = RA1 (Z/A) A1 / (Z/A)
V širokom rozsahu hodnôt E max maximálny počet najazdených kilometrov súvisí s maximálnou energiou podľa vzťahu:
R m= 412 E max 1,265 – 0,0954 lnE max
Rozdiel v rozsahoch, ionizačnej schopnosti a hustote vyvinutých emulzných kryštálov pre častice s rôznymi energiami možno využiť na rozlíšenie distribúcie prvkov, ak sa ich izotopy výrazne líšia v E max, ako v prípade trícia a 14 C. Diskriminácia distribúcia dvoch izotopov sa uskutočňuje nanesením dvoch vrstiev emulzie na vzorku, prvá vrstva registruje prevažne mäkké žiarenie, druhá - tvrdé. Podľa niektorých prác sa dajú z veľkosti kryštálov vyvinutej emulzie spoľahlivo oddeliť rôzne izotopy - kryštály ovplyvnené beta časticou trícia, ktorá má vyššiu ionizačnú silu, sú väčšie.
Vnútorné konverzné elektróny vznikajú, keď je absorbované gama kvantum s veľmi nízkou energiou žiarenia a elektrón je odstránený z vnútorného obalu atómu. Tieto elektróny sú podobné mäkkým časticiam beta, ale na rozdiel od nich sú monoenergetické. Prítomnosť vnútorných konverzných elektrónov umožňuje použitie izotopov, ako je 125I.
V súčasnosti sú najčastejšie používané izotopy emitujúce beta častice. Trícium sa spravidla používa na značenie v histologických štúdiách. Prvé autogramy s použitím trícia boli vyrobené už v 50. rokoch 20. storočia (Fitzgerald et al. 1951), ale jeho široké používanie sa začalo po získaní tymidínu označeného tríciom v laboratóriu v Brookhaven. Keďže vodík je súčasťou všetkých organických látok, pomocou trícia môžete získať rôzne zlúčeniny, ktoré nesú rádioaktívnu značku. Čím nižšia je energia emitovanej častice, tým kratšiu stopu zanecháva pri pohybe vo fotografickej emulzii a tým presnejšie je možné lokalizovať polohu označeného atómu. Dĺžka dráhy častíc trícia beta je cca 1-2 μm, najpravdepodobnejšia energia je 0,005 MeV a dráha pozostáva vo väčšine prípadov z jediného strieborného zrna, čo umožňuje lokalizovať zdroj žiarenia nielen v relatívne veľkých bunkových štruktúr, ako je jadro, ale aj v jednotlivých chromozómoch.
Zavedenie „značených“ metabolitov do tela umožňuje sledovať inkorporáciu izotopu do buniek živočíšnych tkanív, čo umožňuje študovať rôzne biochemické procesy v živom organizme.
Získanie absolútnych údajov - koncentrácia značenej látky v skúmanom objekte je málokedy cieľom rádioautografického výskumu, na to je potrebné poznať množstvo podmienok, ktorých určenie je náročné. Preto sa kvantitatívne rádioautografické štúdie zvyčajne uskutočňujú porovnaním koncentrácie zŕn striebra nad testovaným objektom a kontrolou, pričom kontrolné údaje sa bežne berú ako jedna alebo 100 %.
Charakteristika niektorých použitých izotopov
v rádioautografii biologických objektov
Beta-častice rádioaktívneho fosforu sú schopné v jadrovej emulzii preletieť na vzdialenosť až niekoľko milimetrov, dráha pozostáva z desiatok zriedkavo lokalizovaných častíc striebra - napríklad rádioaktívny fosfor možno použiť len na štúdium distribúcie izotopu v tkanivách nie je možné zistiť lokalizáciu v jednotlivých bunkových štruktúrach.
Rádioaktívna síra a uhlík sa môžu použiť na lokalizáciu izotopu v jednotlivých bunkách za predpokladu, že sú veľké alebo sú od seba dostatočne vzdialené, čo sa dá dosiahnuť v krvných náteroch alebo bunkových suspenziách.
Chyby rozlíšenia a metódy, chyby metódy.
geometrická chyba– vzhľadom na skutočnosť, že emitovaná častica môže byť nasmerovaná v akomkoľvek uhle k povrchu fotovrstvy. V dôsledku toho sa strieborné zrno vo fotovrstve nemusí nachádzať presne nad rádioaktívnym atómom, ale môže byť viac či menej posunuté v závislosti od smeru pohybu častíc a dĺžky dráhy (energie).
foto chyba vzniká v dôsledku skutočnosti, že zrnko striebra pozostávajúce z tisícov atómov kovu je oveľa väčšie ako rádioaktívny atóm. Lokalizácia menšieho objektu sa teda musí posudzovať na základe polohy väčšieho objektu.
Pri použití trícia, ktoré sa vyznačuje nízkou energiou (najazdenými kilometrami) emitovaných častíc a jadrových fotografických emulzií s nízkou zrnitosťou, leží rozlíšenie autorádiografickej metódy v rozlíšení optických systémov - 1 μm. Tieto chyby teda nemajú zásadný vplyv na výsledok.
Pre dosiahnutie lepšieho rozlíšenia je potrebné zmenšiť hrúbku rezu, vrstvu emulzie a vzdialenosť medzi nimi. Vzorka by mala byť mierne podexponovaná.
Účinok automatickej absorpcie: Počet strieborných zŕn závisí od stupňa absorpcie žiarenia bunkovými štruktúrami, vzhľadom na nízky dosah a nízku energiu beta častíc je ich absorpcia v tkanivách pomerne veľká, čo môže viesť k strate znamienka, preto je otázka tzv. hrúbka sekcií je dôležitá. Ukázalo sa, že počet strieborných zŕn je úmerný rádioaktivite tkaniva len pri hrúbke plátu nie väčšej ako 5 mikrónov.
Relatívny počet beta častíc, ktoré prešli cez vrstvu absorbéra s hrúbkou X možno odhadnúť podľa Baerovho zákona -
N X/N 0 = e - m X
kde m je absorpčný koeficient (prevrátená hodnota hrúbky vrstvy, pri prechode ktorej počet častíc klesá v r. e raz. Z hodnoty R možno približne odhadnúť hodnotu absorpčného koeficientu m(maximálny rozsah), známy pre všetky izotopy, pomocou vzťahu m R m= 10, čo platí pre nie príliš tvrdé žiarenie.
Ak sa vo vrstve s jednotkovou hrúbkou za jednotku času pohybuje n častíc smerom k povrchu, potom vo vzorke s hrúbkou X povrch dosiahne N častíc:
Pozadie a artefakty: Chybu v meraniach môžu vniesť aj mechanické vplyvy - škrabance, praskliny emulzie vedúce k vytvoreniu latentného obrazu a vyžarovanie pozadia, s čím treba počítať pri spracovaní autogramov. Pozadie sa berie do úvahy spočítaním počtu strieborných zŕn v prázdnej oblasti prípravku. Chyby sú tiež zavedené v dôsledku histologického spracovania rezov - kabeláž pre alkoholy (dehydratácia), zalievanie parafínom, farbenie. Tieto postupy môžu ovplyvniť veľkosť a pomer bunkových štruktúr.
Radiačný účinok označených metabolitov: Vzhľadom na nízku energiu žiarenia spôsobuje trícium v bunke významnú ionizáciu, oveľa väčšiu ako radiačný účinok častíc uhlíka beta. Výsledkom je, že pri predĺženom pôsobení značenej zlúčeniny, napríklad 3H-tymidínu, sú bunky zničené a odumierajú, čo vedie k zastaveniu rastu tkaniva. V prvom rade je narušená spermatogenéza. Existujú dôkazy o mutagénnych a karcinogénnych účinkoch označených metabolitov. Pozorované cytologické zmeny spočívajú v narušení prechodu mitotického cyklu bunkami, v zmenách bunkovej ploidie a vo výskyte chromozomálnych aberácií. Zdá sa však, že škodlivý účinok izotopu na bunky môže výrazne ovplyvniť výsledky štúdie iba za podmienok dlhého experimentu.
Kvantifikácia rádioaktivity
V experimente sa spravidla neurčuje absolútne, ale relatívne množstvo obsiahnutého izotopu. Mieru začlenenia etikety možno posudzovať dvoma spôsobmi – denzitometricky – čo je vhodnejšie pre makroautografy a priame počítanie strieborných zŕn nad predmetmi. Tento časovo náročný postup je v súčasnosti možné vykonať pomocou počítača. Digitálny obraz histologického preparátu je spracovaný špeciálnym softvérom, aby sa na ňom automaticky zvýraznili bunky a bunkové štruktúry a spočítal sa počet strieborných zŕn. Ak vyvstane otázka kvantitatívneho hodnotenia, je potrebné zahrnúť koncept efektívnosti. Účinnosťou sa najčastejšie rozumie počet zŕn striebra vytvorených pri registrácii jedného rádioaktívneho rozpadu. Účinnosť metódy je ovplyvnená mnohými faktormi, predovšetkým hrúbkou objektu a emulzie.
V štúdiách s použitím scintilačného počítača sa zistila vysoká korelácia medzi priemerným počtom rozpadov za minútu a počtom zŕn striebra. Podľa Hunta (Hunt and Foote, 1967) tvorba jedného zrna v emulzii použitej v experimente zodpovedá 5,8 rádioaktívnym rozpadom, t.j. účinnosť metódy je 17,8 %.
Na kvantifikáciu trícia v makroskopických preparátoch možno použiť vzorky so štandardnou aktivitou, ktoré sú namontované na rovnakom autograme.
Presné posúdenie rádioaktivity porovnávaných biologických objektov je veľmi náročné.
Klasickým príkladom rádioautografickej štúdie je práca o akumulácii 32P v DNA koreňových buniek bôbu konského (Howard a Pelc, 1953). V tomto experimente sa po prvýkrát ukázalo rozdelenie mitotického cyklu na štyri obdobia (mitóza - M, G 1 - predsyntetické obdobie, S - syntéza DNA, premitotické obdobie G 2), že obdobie syntézy DNA zaberá obmedzený časť interfázy, ktorá je časovo oddelená od začiatku a konca mitózy. Údaje Howarda a Pelka neskôr potvrdili presnejšie experimenty s použitím špecifického prekurzora DNA, 3H-tymidínu.
Metódy hodnotenia syntézy proteínov. Najbežnejšími prekurzormi na hodnotenie celkovej syntézy proteínov v rádioautografických štúdiách sú 3H-leucín, 3H-metionín, 3H-fenylalanín. Napríklad syntéza celkového proteínu v mozgu potkanov počas prvých týždňov postnatálneho vývoja bola študovaná pomocou leucínovej značky (Pavlik a Jakoubek, 1976). Na štúdium syntézy histónov a ich vplyvu na reguláciu transkripcie sa využívajú základné aminokyseliny 3H-lyzín a 3H-arginín a na štúdium syntézy kyslých bielkovín 3H-tryptofán. Hustota inklúzií aminokyselinovej značky zodpovedá intenzite syntézy proteínov, a preto odráža funkčnú aktivitu neurónu. Rádioautografická metóda umožňuje porovnávať charakteristiky syntézy bielkovín v rôznych živočíšnych tkanivách pri experimentálnej expozícii a umožňuje sledovať dynamiku zmien na úrovni jednotlivých typov buniek a bunkových štruktúr (jadro, telo bunky, procesy neurónov – axonálne doprava).
V súčasnosti sa autorádiografia často používa na štúdium mozgu v štúdiách s použitím rádioligandov pre určité receptory. Tak boli skonštruované mapy distribúcie rôznych receptorov v mozgových štruktúrach zvierat a ľudí.
Autorádiografia sa používa aj na vizualizáciu gélov v biochémii a v kombinácii s imunotestami (RIA).
Referencie:
1. Epifanova O.I. a kol., Rozhlasový autogram M., Vyššia škola, 1977
2. Sarkisov D.S. Perov Yu.L. Mikroskopická technika M.: "Medicína", 1996
3.Rogers A.W. Praktická autorádiografia, Amersham UK, 1982
4.Bokshtein S.Z. Ginzburg S.S. a kol. Elektrón-mikroskopická autorádiografia vo vede o kovoch M., "Metalurgia"
Autorádiogram a fiya, autorádiografia, autorádiografia , metóda na štúdium distribúcie rádioaktívnych látok v skúmanom objekte nanesením fotografickej emulzie citlivej na rádioaktívne žiarenie na objekt. Rádioaktívne látky obsiahnuté v objekte fotiť sa(odtiaľ názov). Metóda autorádiografie je široko používaná vo fyzike a technike, v biológii a medicíne, všade tam, kde sa používajú izotopové indikátory.
Po vyvolaní a zafixovaní fotografickej emulzie sa na nej získa obrázok, ktorý zobrazuje študovanú distribúciu. Fotografickú emulziu môžete na objekt naniesť niekoľkými spôsobmi. Na vyleštený povrch vzorky možno priamo naniesť fotografickú platňu alebo na vzorku naniesť teplú tekutú emulziu, ktorá po stuhnutí vytvorí vrstvu tesne priliehajúcu k vzorke a po expozícii a spracovaní fotografie sa skúma. Distribúcia rádioaktívnych látok sa skúma porovnávaním hustota sčernenia filmu z testovanej a referenčnej vzorky(takzvaná makrorádiografia).
Druhá metóda spočíva v spočítaní stôp vytvorených ionizačnými časticami vo fotografickej emulzii, pomocou optické resp elektrónový mikroskop (mikrorádiografia). Táto metóda je oveľa citlivejšia ako prvá. Na získanie makroautogramov sa používajú transparentné a röntgenové emulzie, na mikroautografy špeciálne jemnozrnné emulzie.
Fotografický obraz distribúcie rádioaktívnych látok v skúmanom objekte, získaný autorádiografiou, sa nazýva tzv autorádiogram alebo rádioautograf.
Zavedenie zlúčenín označených rádioizotopmi do tela a ďalšie vyšetrenie tkanív a buniek autorádiografiou umožňuje:
- získať presné informácie o ktoré bunky alebo bunkových štruktúr, dochádza k určitým procesom,
- lokalizované látky,
- nastaviť časové parametre pre množstvo procesov.
Napríklad použitie rádioaktívneho fosforu a autorádiografia umožnili zistiť prítomnosť intenzívneho metabolizmu v rastúcej kosti; použitie rádiojódu a autorádiografie umožnili objasniť vzorce činnosti štítnej žľazy; zavedenie značených zlúčenín - prekurzorov proteínov a nukleových kyselín a autorádiografia pomohli objasniť úlohu určitých bunkových štruktúr pri výmene týchto životne dôležitých zlúčenín. Metóda autorádiografie umožňuje určiť nielen lokalizáciu rádioizotopu v biologickom objekte, ale aj jeho množstvo, pretože počet redukovaných strieborných zŕn emulzie je úmerný počtu častíc, ktoré ju ovplyvňujú. Kvantitatívna analýza makroautografy sa vykonávajú bežnými metódami fotometrie a mikroautografy - počítaním pod mikroskopom strieborných zŕn alebo stôp, ktoré vznikli v emulzii pôsobením ionizujúcich častíc. Autorádiografia sa začína úspešne kombinovať s elektrónovou mikroskopiou
