Авторадіографія. Радіоавтографія Метод авторадіографії у цитології
Авторадіографія ауторадіографія, радіоавтографія, метод вивчення розподілу радіоактивних речовин у об'єкті, що досліджується, накладенням на об'єкт чутливої до радіоактивних випромінювань фотоемульсії. Радіоактивні речовини, що містяться в об'єкті, як би самі себе фотографують (звідси і назва). Методом А. широко користуються у фізиці та техніці, у біології та медицині – усюди, де застосовуються ізотопні індикатори. Після прояви та фіксації фотоемульсії на ній виходить зображення, що відображає розподіл, що досліджується. Існує кілька способів застосування фотоемульсії до об'єкта. Фотопластинку можна прямо накласти на відшліфовану поверхню зразка або ж можна наносити на зразок рідку теплу емульсію, яка при застиганні утворює щільно прилеглий до зразка шар і після експозиції і фотообробки досліджується. Розподіл радіоактивних речовин вивчають, порівнюючи щільність почорніння фотоплівки від досліджуваного та еталонного зразка (т.зв. макрорадіографія). Другий метод полягає у підрахунку слідів, що утворюються іонізуючими частинками у фотоемульсії, за допомогою оптичного або електронного мікроскопа (мікрорадіографія). Цей метод значно чутливіший за перший. Для отримання макроавтографів застосовуються діапозитивні та рентгенівські емульсії, для мікроавтографів – спеціальні дрібнозернисті емульсії. Фотографічне зображення розподілу радіоактивних речовин в об'єкті, що досліджується, отримане методом А., називається авторадіограмою, або радіоавтографом. на Рис. 1, 2
і 3
наведено приклади авторадіограм. Методом А. можна виявляти присутність радіоактивних елементів у різних рудах, розподіл природних радіоактивних елементів у тканинах рослинних та тваринних організмів тощо. Введення в організм сполук, мічених радіоізотопами, і подальше дослідження тканин і клітин методом А. дозволяє отримати точні дані про те, в яких клітинах або клітинних структурах відбуваються ті чи інші процеси, локалізуються ті чи інші речовини, встановити часові параметри ряду процесів. Так, наприклад, застосування радіоактивного фосфору і А. дали можливість виявити присутність інтенсивного обміну речовин у кістці, що росте; застосування радіоіоду та А. дозволили уточнити закономірності діяльності щитовидної залози; введення мічених сполук - попередників білка та нуклеїнових кислот, і А. допомогли усвідомити роль в обміні цих життєво важливих сполук певних клітинних структур. Метод А. дозволяє визначити не тільки локалізацію радіоізотопу в біологічному об'єкті, але і його кількість, оскільки кількість відновлених зерен срібла емульсії пропорційно кількості частинок, що впливають на неї. Кількісний аналіз макроавтографів проводять звичайними прийомами фотометрії. ,
а мікроавтографів - підрахунком під мікроскопом зерен срібла або слідів-треків, що виникли в емульсії під дією іонізуючих частинок. А. починають успішно поєднувати з електронною мікроскопією. також Радіографія. Літ.:Бойд Д. А. Авторадіографія в біології та медицині, пров. з англ., М., 1957; Жінкін Л. Н., Застосування радіоактивних ізотопів у гістології, в кн.: Радіоактивні індикатори в гістології, Л., 1959, с. 5-33; Perry R., Quantitative autoradiography, "Методи в Cell Physiology", 1964, v. I, ch. 15, p. 305-26. Н. Г. Хрущов. Рис. 2. Авторадіограма (відбиток), що показує розподіл фосфору (32 Р) у листі помідора. Рослина поміщалася попередньо розчин, що містить радіоактивний фосфор. Світлі ділянки відповідають підвищеним концентраціям радіоактивного ізотопу; можна бачити, що фосфор сконцентрувався біля стебла та в судинних частинах листя. Рис. 1. Мікрорадіограма зразка нікелю. Досліджується дифузія олова, міченого радіоактивним ізотопом 113 Sn, у нікелі. Розподіл радіоактивного олова показує, що дифузія переважно відбувається за межами зерен нікелю.
Велика Радянська Енциклопедія. - М: Радянська енциклопедія. 1969-1978 .
Синоніми:Дивитись що таке "Авторадіографія" в інших словниках:
- (від авто і радіографія) метод реєстрації розподілу радіоактивних речовин в об'єкті. Плівка з чутливою до радіоактивного випромінювання емульсією накладається на поверхню (зріз). Радіоактивні речовини як би самі себе фотографують. Великий Енциклопедичний словник
- (Радіоавтографія), метод вимірювання розподілу радіоакт. в досліджуваному об'єкті (за їх власністю. випромінювання), що полягає в нанесенні на нього шару ядерної фотографічної емульсії. Розподіл визначають за щільністю почорніння проявленою… … Фізична енциклопедія
Метод вивчення розподілу радіоактивних речовин (ізотопів) у досліджуваному об'єкті чи сполуках. Полягає у накладенні на об'єкт (або, напр., хроматограму) чутливої до радіоактивних випромінювань фотоемульсії та отримання відбитка, … Словник мікробіології
Сут., кіл у синонімів: 4 авторадіографія (2) макроавторадіографія (1) … Словник синонімів
Авторадіографія. Див. радіоавтографія. (Джерело: «Англо-російський тлумачний словник генетичних термінів». Ареф'єв В.А., Лісовенко Л.А., Москва: Вид у ВНІРО, 1995 р.) … Молекулярна біологія та генетика. Тлумачний словник.
авторадіографія- Метод вивчення розподілу радіоакт. компонентів у досліджуваному зразку за їх власним випромінюванням шляхом накладання на зразок чутливої до радіоакт. випромінюванням фотоемульсії. Розподіл визначають за щільністю почорніння проявленою… … Довідник технічного перекладача
Авторадіографія- * авторадіографія * autoradiography см … Генетика. Енциклопедичний словник
- (від авто і радіографія), метод реєстрації розподілу радіоактивних речовин в об'єкті. Плівка з чутливою до радіоактивного випромінювання емульсією накладається на поверхню (зріз). Радіоактивні речовини як би самі себе фотографують. Енциклопедичний словник
Книги
- Авторадіографія в біології та медицині, Дж. Бойд, Книга належить одному із творців методу авторадіографії. Перші вісім розділів присвячені теорії питання. Вони розглянуті теорія фотографічного процесу, властивості та особливості… Категорія: Основи медичних знаньВидавець:
Радіоавтографія – порівняно новий метод, що безмірно розширив можливості як світлової, так і електронної мікроскопії. Це сучасний метод, зобов'язаний своїм виникненням розвитку ядерної фізики, яке уможливило отримання радіоактивних ізотопів різних елементів. Для радіоавтографії необхідні, зокрема, ізотопи тих елементів, які використовуються клітиною або можуть зв'язуватися з речовинами, що використовуються клітиною, і які можна вводити тваринам або додавати до культур у кількостях, що не порушують нормального метаболізму клітин. Оскільки радіоактивний ізотоп (або позначена ним речовина) бере участь у біохімічних реакціях так само, як його нерадіоактивний аналог, і в той же час випромінює випромінювання, шлях ізотопів в організмі можна простежити за допомогою різних методів виявлення радіоактивності. Один із способів виявлення радіоактивності заснований на її здатності діяти на фотоплівку подібно до світла; але радіоактивне випромінювання проникає крізь чорний папір, що використовується для того, щоб захистити фотоплівку від світла, і робить на плівку таку ж дію, як світло.
Щоб на препаратах, призначених для вивчення за допомогою світлового або електронного мікроскопів, можна було виявити випромінювання радіоактивними ізотопами, що препарати покривають у темному приміщенні особливою фотоемульсією, після чого залишають на деякий час у темряві. Потім препарати виявляють (теж у темряві) та фіксують. Ділянки препарату, що містять радіоактивні ізотопи, впливають на емульсію, що лежить над ними, в якій під дією випромінювання, що випускається, виникають темні «зерна». Таким чином отримують радіоавтографи (від грец. радіо- променеподібний, аутос– сам і графо– писати).
Спочатку гістологи мали лише кілька радіоактивних ізотопів; так, наприклад, у багатьох ранніх дослідженнях із застосуванням радіоавтографії використовувався радіоактивний фосфор. Пізніше почали використовувати значно більше таких ізотопів; особливо широкого застосування знайшов радіоактивний ізотоп водню – тритій.
Радіоавтографія мала і має досі дуже широке застосування вивчення того, де і як в організмі протікають ті чи інші біохімічні реакції.
Хімічні сполуки, мічені радіоактивними ізотопами, що використовуються для дослідження біологічних процесів, називають попередниками. Попередники – це зазвичай речовини, подібні до тих, які організм отримує з їжі; вони служать будівельними блоками для побудови тканин і включаються до складних компонентів клітин і тканин таким же чином, як у них включаються немічені будівельні блоки. Компонент тканини, який включається мічений попередник і який випускає випромінювання, називається продуктом.
Клітини, що вирощуються в культурі, хоча і належать до одного і того ж типу, у будь-який момент часу будуть знаходитися на різних стадіях клітинного циклу, якщо не вжити спеціальних заходів для синхронізації їх циклів. Тим не менш, шляхом введення в клітини тритій-тимідину та подальшого виготовлення радіоавтографів можна визначити тривалість різних стадій циклу. Час настання однієї стадії – мітозу – можна визначити і без міченого тимідину. Для цього вибірку клітин із культури тримають під наглядом у фазово-контрастному мікроскопі, який дає можливість безпосередньо стежити за перебігом мітозу та встановлювати його терміни. Тривалість мітозу зазвичай дорівнює 1 год, хоча клітинах деяких типів він займає до 1.5 год.
Метод радіоавтографії
Радіоавтографія, визначення, історія.
Метод радіоавтографії заснований на введенні у досліджуваний об'єкт з'єднання, "міченого" радіоактивним атомом та виявлення місця його включення шляхом фотографічної реєстрації випромінювання. Основою отримання зображення є вплив іонізуючих частинок, що утворюються при розпаді радіоактивного атома на ядерну фотоемульсію, що містить кристали галоїдного срібла.
Відкриття методу радіоавтографії безпосередньо з відкриттям явища радіоактивності. В 1867 було опубліковано перше спостереження про вплив солей урану на галогеніди срібла (Niepce de St.Victor). 1896 року Генрі Беккерель спостерігав засвічування фотопластинки солями урану без попередньої експозиції на світлі. Цей експеримент вважається моментом відкриття явища радіоактивності. Радіоавтографію стосовно біологічного матеріалу вперше використовували Лакассань і Латтье (Lacassagne, Lattes 1924) у 20-х роках минулого століття; гістологічний блок від різних органів тварин після введення ним ізотопів притискали плоскою стороною до рентгенівської платівки та експонували. Заздалегідь отримували гістологічний зріз та піддавали стандартній процедурі фарбування. Отриманий автограф вивчали окремо від зрізу. Цей метод дозволяє оцінити інтенсивність включення ізотопу до біологічного зразка. У сорокових роках Леблон використовував радіоавтографію для демонстрації розподілу ізотопу йоду у зрізах щитовидної залози (Leblond C.P. 1943).
Перші спроби поєднувати радіоавтографію з електронною мікроскопією було зроблено у 50-ті роки (Liquir-Milward, 1956). Електронно-мікроскопічна радіоавтографія є окремим випадком звичайної радіоавтографії, при якому також підраховуються зерна срібла і враховується їх розподіл. Особливість методу полягає у застосуванні дуже тонкого шару емульсії. В даний час досягнуто роздільної здатності близько 50 нм, що в 10-20 разів вище в порівнянні зі світловою мікроскопією.
В даний час метод радіоавтографії доповнено можливістю автоматичної оцінки кількості зерен срібла за допомогою відеоаналізаторів. Часто для посилення сигналу мітки (як правило, це ізотопи з високими енергіями) застосовуються різні види сцинтиляторів, нанесені на пластини (підсилюючий екран з фосфорним покриттям), або імпрегновані в емульсію (PPO) – у такому випадку випромінювання фотонів засвічує звичайну фотопластину або фотоплівку.
Фотографічний принцип отримання зображення, фотоемульсії
У радіографічному дослідженні роль детектора ядерних розпадів виконує фотоемульсія, в якій при проходженні іонізуючої частинки залишається приховане зображення, яке потім виявляється в процесі прояви, аналогічно обробці звичайної фотоплівки.
Фотоемульсія представляє собою завись мікрокристалів галоїдного срібла в желатині. Мікрокристали мають дефекти у структурі, які називають центрами чутливості. Відповідно до моделі Герні-Мотта ці порушення іонної решітки кристала здатні захоплювати електрони, що вивільнилися при проходженні альфа-або бета-частинки в зоні провідності кристала, внаслідок чого іон перетворюється на атом. Приховане зображення, що утворилося, може бути виявлено за допомогою процедури, в результаті якої активовані кристали галоїдного срібла перетворюються на зерна металевого срібла (цей процес називається хімічним проявом). Як проявник може бути використаний будь-який агент з достатньою відновлюючою активністю (типово у фотографії та авторадіографії використовуються метол, амідол або гідрохінон). Після прояву експонованих кристалів інші мікрокристали срібла галоїдного видаляють з емульсії за допомогою фіксатора (зазвичай - гіпосульфіт). Ядерні фотоемульсії характеризується роздільною здатністю (зернистістю) та чутливістю. Перша визначається розміром мікрокристалів солі срібла і обернено пропорційна останній. Фотоемульсія характеризується зниженою чутливістю до видимого світла, але з нею, тим щонайменше, повинна проводиться у темряві, щоб виключити появу артефактів.
Емульсія може наносити на препарат у вигляді готової плівки з підкладкою або зануренням препарату в розігріту рідку емульсію - таким чином виходить тонкий рівномірний шар, який проявляється звичайним способом. Перед нанесенням емульсії для світлової мікроскопії препарат зазвичай забарвлюють необхідним гістологічним забарвленням, але більш блідо, ніж зазвичай, щоб уможливити підрахунок зерен срібла на всіх ділянках. Певний час препарат експонують, потім виявляють.
Ізотопи, які використовуються в радіоавтографії.
У радіоавтографії в залежності від цілей дослідження та доступних матеріалів можливе застосування різних ізотопів. Зображення, що створюється іонізуючою часткою на ядерній фотоемульсії залежить від енергії частинки та типу її взаємодії з речовиною.
Альфа-частинки, що випускаються однаковими радіоактивними ядрами, мають однакову енергію ( E) та однаковою довжиною пробігу ( R) , пов'язаними наступним співвідношенням:
R = kE3/2
Де k – константа, що характеризує середовище, у якому поширюються частки. Величина пробігу частинок у серді визначається її щільністю та елементарним складом. Співвідношення Брегга-Клімена дозволяє за величиною пробігу альфа-частинок у повітрі (R0) оцінити пробіг у речовині з атомною масою A та щільністю d:
R= 0,0003 (R0 / d) A1/2
Оскільки іонізуюча здатність альфа-часток дуже висока, це полегшує фотографічну реєстрацію розподілу ізотопу, а також дозволяє використовувати для реєстрації неемульсійні матеріали. Слід альфа-частинок, що випускаються одним джерелом, на автографах виглядає як пучок прямолінійних відрізків, зазвичай довжиною 15-50 мкм, що виходять з однієї точки, що дозволяє точно локалізувати ділянку включення радіоактивної мітки. Однак, альфа-частинки випускаються ізотопами з великими атомними номерами, що обмежує можливість їх застосування як біологічну мітку.
Треки альфа-частинок часто спостерігаються в гістологічних радіоавтографах як артефакт - результат власного випромінювання ізотопів, що знаходяться в предметному склі.
Бета випромінювання характеризується безперервним спектром початкової енергії частинок – від нуля до певної кожного ізотопу E max. Форми спектру суттєво відрізняються. Так, найімовірніша енергія частинок, випромінюваних тритем становить 1/7 від E max, 14C – близько ¼, 32P – близько 1/3. Максимальна енергія бета-випромінювання різних ізотопів змінюється в межах від 18 кеВ до 3.5 МеВ – у значно ширших межах, ніж альфа-випромінювання. Як правило, максимальна енергія вища у короткоживучих ізотопів.
Проходження бета-часток та моноенергетичних електронів через речовину супроводжується двома основними типами взаємодії. При взаємодії з орбітальним електроном частка може передати йому енергію, достатню для іонізації атома (видалення електрона з орбіти). У поодиноких випадках ця енергія настільки велика, що можна спостерігати трек звільненого електрона. Через рівність мас частинки та електрона відбувається відхилення від початкового руху. Взаємодія другого типу з атомними ядрами призводить до виникнення гальмівного рентгенівського випромінювання. Хоча останнє і не реєструється емульсією, акт взаємодії частки з ядром може бути виявлений по різкому зламу траєкторії.
Багаторазова взаємодія з орбітальними електронами призводить до викривлення траєкторії, яка зазвичай виглядає як звивиста лінія, особливо в кінцевій частині, коли швидкість частки падає, а іонізуюча здатність зростає. Довжина траєкторії помітно перевищує відстань від початкової до кінцевої точки треку – пробіг. Тому навіть для моноенергетичних електронів характерна наявність спектру пробігів, обмеженого зверху R max, харакерним для даного випромінювання. Через нижчі іонізаційні втрати бета частинки реєструються з більшими складнощами, ніж альфа-частинки. Вони не утворюють суцільних треків (крім найм'якшого випромінювання тритію – проте в цьому випадку мала ймовірність проходження більш ніж через один кристал емульсії), щільність і кількість виявлених кристалів варіюють у різних межах. Пробіг бета-частинки в іншому елементі може бути оцінений за формулою:
R = RA1 (Z/A)A1/(Z/A)
У широкому діапазоні значень E max максимальний пробіг пов'язаний із максимальною енергією співвідношенням:
R m= 412 E max 1.265 - 0,0954 ln E max
Відмінність у пробігах, іонізаційної здатності та щільності виявлених емульсійних кристалів у частинок з різною енергією може бути використана для дискримінації розподілу елементів, якщо їх ізотопи істотно відрізняються по E max, як у випадку з тритієм та 14С. Дискримінацію розподілу двох ізотопів здійснюють за допомогою нанесення на зразок двох емульсійних шарів, перший реєструє переважно м'яке випромінювання, другий - жорстке. Згідно з деякими роботами різні ізотопи можуть бути надійно виділені за розміром виявлених емульсійних кристалів - кристали, порушені бета-частинкою тритію, що має більшу іонізаційну здатність, мають великі розміри.
Електрони внутрішньої конверсії утворюються при поглинанні гамма кванта з дуже низькою енергією випромінювання та видалення електрона з внутрішньої оболонки атома. Ці електрони подібні до м'яких бета-часток, але на відміну від останніх є моноенергетичними. Наявність електронів внутрішньої конверсії дозволяє використовувати такі ізотопи, як 125I.
В даний час найчастіше використовуються ізотопи, що випромінюють бета-частинки. Як правило, для мітки в гістологічних дослідженнях використовується тритій. Перші автографи з використання тритію були виготовлені ще в 50-і роки (Fitzgerald et al. 1951), проте широке його застосування почалося після того, як у Брукхевенській лабораторії було отримано мічений тритієм тимідин. Оскільки водень входить до складу всіх органічних речовин, то, використовуючи тритій, можна отримувати різні сполуки, що несуть радіоактивну мітку. Чим менше енергія частки, що випускається, тим коротше трек, що залишається їй при русі в фотоемульсії і тим точніше можна локалізувати розташування міченого атома. Довжина пробігу бета-частинок тритію близько 1-2 мкм, найбільш ймовірна енергія 0,005 МеВ, а трек полягає в більшості випадків з одного зерна срібла, що дозволяє локалізувати джерело випромінювання не тільки відносно великих клітинних структурах, таких як ядро, але і в окремих хромосоми.
Введення "мічених" метаболітів в організм дозволяє простежити включення ізотопу в клітини тканин тварини, що дає можливість досліджувати різні біохімічні процеси в живому організмі.
Отримання абсолютних даних – концентрації міченої речовини в об'єкті, що вивчається, рідко буває метою радіоавтографічного дослідження, для цього необхідне знання низки умов, визначення яких утруднено. Тому кількісні радіоавтографічні дослідження зазвичай проводять шляхом порівняння концентрації зерен срібла над об'єктом і контролем, що досліджується, при цьому контрольні дані зручно приймати за одиницю, або 100%.
Характеристики деяких ізотопів, які використовуються
у радіоавтографії біологічних об'єктів
Метод радіоавтографії
Радіоавтографія, визначення, історія.
Метод радіоавтографії заснований на введенні у досліджуваний об'єкт з'єднання, "міченого" радіоактивним атомом та виявлення місця його включення шляхом фотографічної реєстрації випромінювання. Основою отримання зображення є вплив іонізуючих частинок, що утворюються при розпаді радіоактивного атома на ядерну фотоемульсію, що містить кристали галоїдного срібла.
Відкриття методу радіоавтографії безпосередньо з відкриттям явища радіоактивності. В 1867 було опубліковано перше спостереження про вплив солей урану на галогеніди срібла (Niepce de St.Victor). 1896 року Генрі Беккерель спостерігав засвічування фотопластинки солями урану без попередньої експозиції на світлі. Цей експеримент вважається моментом відкриття явища радіоактивності. Радіоавтографію стосовно біологічного матеріалу вперше використовували Лакассань і Латтье (Lacassagne, Lattes 1924) у 20-х роках минулого століття; гістологічний блок від різних органів тварин після введення ним ізотопів притискали плоскою стороною до рентгенівської платівки та експонували. Заздалегідь отримували гістологічний зріз та піддавали стандартній процедурі фарбування. Отриманий автограф вивчали окремо від зрізу. Цей метод дозволяє оцінити інтенсивність включення ізотопу до біологічного зразка. У сорокових роках Леблон використовував радіоавтографію для демонстрації розподілу ізотопу йоду у зрізах щитовидної залози (Leblond C.P. 1943).
Перші спроби поєднувати радіоавтографію з електронною мікроскопією було зроблено у 50-ті роки (Liquir-Milward, 1956). Електронно-мікроскопічна радіоавтографія є окремим випадком звичайної радіоавтографії, при якому також підраховуються зерна срібла і враховується їх розподіл. Особливість методу полягає у застосуванні дуже тонкого шару емульсії. В даний час досягнуто роздільної здатності близько 50 нм, що в 10-20 разів вище в порівнянні зі світловою мікроскопією.
В даний час метод радіоавтографії доповнено можливістю автоматичної оцінки кількості зерен срібла за допомогою відеоаналізаторів. Часто для посилення сигналу мітки (як правило, це ізотопи з високими енергіями) застосовуються різні види сцинтиляторів, нанесені на пластини (підсилюючий екран з фосфорним покриттям), або імпрегновані в емульсію (PPO) – у такому випадку випромінювання фотонів засвічує звичайну фотопластину або фотоплівку.
Фотографічний принцип отримання зображення, фотоемульсії
У радіографічному дослідженні роль детектора ядерних розпадів виконує фотоемульсія, в якій при проходженні іонізуючої частинки залишається приховане зображення, яке потім виявляється в процесі прояви, аналогічно обробці звичайної фотоплівки.
Фотоемульсія представляє собою завись мікрокристалів галоїдного срібла в желатині. Мікрокристали мають дефекти у структурі, які називають центрами чутливості. Відповідно до моделі Герні-Мотта ці порушення іонної решітки кристала здатні захоплювати електрони, що вивільнилися при проходженні альфа-або бета-частинки в зоні провідності кристала, внаслідок чого іон перетворюється на атом. Приховане зображення, що утворилося, може бути виявлено за допомогою процедури, в результаті якої активовані кристали галоїдного срібла перетворюються на зерна металевого срібла (цей процес називається хімічним проявом). Як проявник може бути використаний будь-який агент з достатньою відновлюючою активністю (типово у фотографії та авторадіографії використовуються метол, амідол або гідрохінон). Після прояву експонованих кристалів інші мікрокристали срібла галоїдного видаляють з емульсії за допомогою фіксатора (зазвичай - гіпосульфіт). Ядерні фотоемульсії характеризується роздільною здатністю (зернистістю) та чутливістю. Перша визначається розміром мікрокристалів солі срібла і обернено пропорційна останній. Фотоемульсія характеризується зниженою чутливістю до видимого світла, але з нею, тим щонайменше, повинна проводиться у темряві, щоб виключити появу артефактів.
Емульсія може наносити на препарат у вигляді готової плівки з підкладкою або зануренням препарату в розігріту рідку емульсію - таким чином виходить тонкий рівномірний шар, який проявляється звичайним способом. Перед нанесенням емульсії для світлової мікроскопії препарат зазвичай забарвлюють необхідним гістологічним забарвленням, але більш блідо, ніж зазвичай, щоб уможливити підрахунок зерен срібла на всіх ділянках. Певний час препарат експонують, потім виявляють.
Ізотопи, які використовуються в радіоавтографії.
У радіоавтографії в залежності від цілей дослідження та доступних матеріалів можливе застосування різних ізотопів. Зображення, що створюється іонізуючою часткою на ядерній фотоемульсії залежить від енергії частинки та типу її взаємодії з речовиною.
Альфа-частинки, що випускаються однаковими радіоактивними ядрами, мають однакову енергію ( E) та однаковою довжиною пробігу ( R) , пов'язаними наступним співвідношенням:
R = kE 3/2
Де k – константа, що характеризує середовище, у якому поширюються частки. Величина пробігу частинок у серді визначається її щільністю та елементарним складом. Співвідношення Брегга-Клімена дозволяє за величиною пробігу альфа-частинок у повітрі (R 0) оцінити пробіг у речовині з атомною масою A та щільністю d:
R= 0,0003 (R 0 / d) A 1/2
Оскільки іонізуюча здатність альфа-часток дуже висока, це полегшує фотографічну реєстрацію розподілу ізотопу, а також дозволяє використовувати для реєстрації неемульсійні матеріали. Слід альфа-частинок, що випускаються одним джерелом, на автографах виглядає як пучок прямолінійних відрізків, зазвичай довжиною 15-50 мкм, що виходять з однієї точки, що дозволяє точно локалізувати ділянку включення радіоактивної мітки. Однак, альфа-частинки випускаються ізотопами з великими атомними номерами, що обмежує можливість їх застосування як біологічну мітку.
Треки альфа-частинок часто спостерігаються в гістологічних радіоавтографах як артефакт - результат власного випромінювання ізотопів, що знаходяться в предметному склі.
Проходження бета-часток та моноенергетичних електронів через речовину супроводжується двома основними типами взаємодії. При взаємодії з орбітальним електроном частка може передати йому енергію, достатню для іонізації атома (видалення електрона з орбіти). У поодиноких випадках ця енергія настільки велика, що можна спостерігати трек звільненого електрона. Через рівність мас частинки та електрона відбувається відхилення від початкового руху. Взаємодія другого типу з атомними ядрами призводить до виникнення гальмівного рентгенівського випромінювання. Хоча останнє і не реєструється емульсією, акт взаємодії частки з ядром може бути виявлений по різкому зламу траєкторії.
Багаторазова взаємодія з орбітальними електронами призводить до викривлення траєкторії, яка зазвичай виглядає як звивиста лінія, особливо в кінцевій частині, коли швидкість частки падає, а іонізуюча здатність зростає. Довжина траєкторії помітно перевищує відстань від початкової до кінцевої точки треку – пробіг. Тому навіть для моноенергетичних електронів характерна наявність спектру пробігів, обмеженого зверху R max, харакерним для даного випромінювання. Через нижчі іонізаційні втрати бета частинки реєструються з більшими складнощами, ніж альфа-частинки. Вони не утворюють суцільних треків (крім найм'якшого випромінювання тритію – проте в цьому випадку мала ймовірність проходження більш ніж через один кристал емульсії), щільність і кількість виявлених кристалів варіюють у різних межах. Пробіг бета-частинки в іншому елементі може бути оцінений за формулою:
R = R A1 (Z/A) A1 / (Z/A)
У широкому діапазоні значень E max максимальний пробіг пов'язаний із максимальною енергією співвідношенням:
R m= 412 E max 1.265 - 0,0954 ln E max
Відмінність у пробігах, іонізаційної здатності та щільності виявлених емульсійних кристалів у частинок з різною енергією може бути використана для дискримінації розподілу елементів, якщо їх ізотопи істотно відрізняються по E max, як у випадку з тритієм і 14 С. Дискримінацію розподілу двох ізотопів здійснюють на зразок двох емульсійних шарів перший шар реєструє переважно м'яке випромінювання, другий - жорстке. Згідно з деякими роботами різні ізотопи можуть бути надійно виділені за розміром виявлених емульсійних кристалів - кристали, порушені бета-частинкою тритію, що має більшу іонізаційну здатність, мають великі розміри.
Електрони внутрішньої конверсії утворюються при поглинанні гамма кванта з дуже низькою енергією випромінювання та видалення електрона з внутрішньої оболонки атома. Ці електрони подібні до м'яких бета-часток, але на відміну від останніх є моноенергетичними. Наявність електронів внутрішньої конверсії дозволяє використовувати такі ізотопи, як 125 I.
В даний час найчастіше використовуються ізотопи, що випромінюють бета-частинки. Як правило, для мітки в гістологічних дослідженнях використовується тритій. Перші автографи з використання тритію були виготовлені ще в 50-і роки (Fitzgerald et al. 1951), проте широке його застосування почалося після того, як у Брукхевенській лабораторії було отримано мічений тритієм тимідин. Оскільки водень входить до складу всіх органічних речовин, то, використовуючи тритій, можна отримувати різні сполуки, що несуть радіоактивну мітку. Чим менше енергія частки, що випускається, тим коротше трек, що залишається їй при русі в фотоемульсії і тим точніше можна локалізувати розташування міченого атома. Довжина пробігу бета-частинок тритію близько 1-2 мкм, найбільш ймовірна енергія 0,005 МеВ, а трек полягає в більшості випадків з одного зерна срібла, що дозволяє локалізувати джерело випромінювання не тільки відносно великих клітинних структурах, таких як ядро, але і в окремих хромосоми.
Введення "мічених" метаболітів в організм дозволяє простежити включення ізотопу в клітини тканин тварини, що дає можливість досліджувати різні біохімічні процеси в живому організмі.
Отримання абсолютних даних – концентрації міченої речовини в об'єкті, що вивчається, рідко буває метою радіоавтографічного дослідження, для цього необхідне знання низки умов, визначення яких утруднено. Тому кількісні радіоавтографічні дослідження зазвичай проводять шляхом порівняння концентрації зерен срібла над об'єктом і контролем, що досліджується, при цьому контрольні дані зручно приймати за одиницю, або 100%.
Характеристики деяких ізотопів, які використовуються
у радіоавтографії біологічних об'єктів
Бета-частинки радіоактивного фосфору здатні пролітати в ядерній емульсії відстані до кількох міліметрів, трек складається з десятків рідко розташованих частинок срібла – так, радіоактивний фосфор може бути використаний лише для вивчення розподілу ізотопу в тканинах, локалізацію в окремих клітинних структурах встановити неможливо.
Радіоактивні сірка та вуглець можуть бути використані для локалізації ізотопу в окремих клітинах, за умови того, що вони великі або розташовані на достатній відстані один від одного, що може бути досягнуто в мазках крові або суспензіях клітин.
Роздільна здатність та похибки методу, помилки методу.
Геометрична помилка– у зв'язку з тим, що частка, що випускається, може бути спрямована під будь-яким кутом до поверхні фотошару. Отже, зерно срібла у фотошарі може бути не точно над радіоактивним атомом, а більш-менш зміщено залежно від напрямку руху частки і довжини пробігу (енергії).
Фотопомилкавиникає у зв'язку з тим, що зерно срібла, що складається з тисяч атомів металу, набагато більше, ніж радіоактивний атом. Отже, про локалізації меншого об'єкта доводиться судити з становища більшого.
При використанні тритію, що характеризується малою енергією (пробігом) часток, що випускаються, і ядерних фотоемульсій з низькою зернистістю роздільна здатність методу радіоавтографії лежить в межах роздільної здатності оптичних систем - 1 мкм. Таким чином, ці помилки не мають суттєвого впливу на отримуваний результат.
Для досягнення кращої роздільної здатності необхідно зменшувати товщину зрізу, шару емульсії та відстань між ними. Препарат слід трохи недоекспонувати.
Ефект автоабсорбції:Число зерен срібла залежить від ступеня поглинання випромінювання клітинними структурами, завдяки малому пробігу та малої енергії бета-часток, їх абсорбція в тканинах досить велика, що може призводити до втрати мітки, тому важливого значення набуває питання про товщину зрізів. Показано, що число зерен срібла пропорційне до радіоактивності тканини тільки при товщині зрізу не більше 5 мк.
Відносне число бета-часток, що пройшли крізь шар поглинача завтовшки хможе бути оцінено за законом Бера –
N x/N 0 = e - m x
Де m - коефіцієнт поглинання (величина, зворотна товщині шару, при проходженні якого число частинок зменшується в eразів. Величину коефіцієнта поглинання можна приблизно оцінити за величиною R m(максимальний пробіг), відомої для всіх ізотопів, за допомогою співвідношення m R m= 10, справедливого для занадто жорстких випромінювань.
Якщо у шарі одиничної товщини в одиницю часу виникає n частинок, що рухаються до поверхні, то у зразку завтовшки хповерхні досягне N частинок:
Фон та артефакти:Помилки у вимірювання можуть вносити також механічні впливи – подряпини, тріщини емульсії, що ведуть до утворення прихованого зображення та фонове випромінювання, яке необхідно враховувати при обробці радіоавтографів. Фон враховують підрахунком кількості зерен срібла на порожній ділянці препарату. Помилки так само вносяться в результаті гістологічної обробки зрізів - проведення спиртів (дегідратації), укладання в парафін, забарвлення. Ці процедури можуть впливати на розміри та співвідношення клітинних структур.
Радіаційний ефект мічених метаболітів:Завдяки малій енергії випромінювання тритій викликає в клітині значну іонізацію, що набагато перевищує радіаційний ефект бета-часток вуглецю. Внаслідок цього при тривалій дії міченої сполуки, наприклад, 3 H-тимідину, відбувається руйнування і загибель клітин, що призводять до зупинки росту тканин. Насамперед порушується сперматогенез. Є дані про мутагенну та канцерогенну дію мічених метаболітів. Спостерігаються цитологічні зміни полягають у порушенні проходження клітинами мітотичного циклу, зміні плідності клітин та появі хромосомних аберацій. Але, мабуть, шкідлива дія ізотопу на клітини може помітно позначатися на результатах дослідження лише в умовах тривалого експерименту.
Кількісна оцінка радіоактивності
Як правило, в експерименті визначають не абсолютну, а відносну кількість ізотопу, що включився. Ступінь включення мітки можна оцінити двома способами – денситометрично – що застосовніше до макроавтографів і прямим підрахунком зерен срібла над об'єктами. Ця трудомістка процедура може бути виконана за допомогою комп'ютера. Цифровий знімок гістологічного препарату обробляється спеціальним програмним забезпеченням, з метою автоматично виділити на ньому клітини та клітинні структури та підрахувати кількість зерен срібла. Якщо постає питання кількісної оцінці – необхідно залучати поняття ефективності. Найчастіше під ефективністю розуміють кількість зерен срібла, що утворюються під час реєстрації одного радіоактивного розпаду. На ефективність методу впливають багато чинників, насамперед товщина об'єкта та емульсії.
У дослідженнях за допомогою сцинтиляційного лічильника було знайдено високу кореляцію між середнім числом розпадів за хвилину та кількістю мережевих зерен срібла. За даними Ханта (Hunt, Foote, 1967) утворення одного зерна в емульсії, що застосовувалася в експерименті, відповідає 5.8 радіоактивних розпадів, тобто ефективність методу становить 17.8%.
Для кількісної оцінки тритію в макроскопічних препаратах можуть бути використані зразки зі стандартною активністю, що монтуються на тому ж автографі.
Точна оцінка радіоактивності порівнюваних біологічних об'єктів дуже складна.
Класичний приклад радіоавтографічного дослідження – це робота з вивчення накопичення 32 P ДНК клітин кореня кінського боба (Howard, Pelc, 1953). У цьому експерименті було вперше показано розподіл мітотичного циклу на чотири періоди (мітоз - M, G 1 - пресинтетичний період, S - синтез ДНК, премітотичний період G 2), що період синтезу ДНК займає обмежену частину інтерфази, відокремлений у часі від початку і закінчення мітозу. Дані Говард і Пелка пізніше знайшли підтвердження у більш точних експериментах із застосуванням спецефічного попередника ДНК – 3 H-тимідину.
Методи оцінки синтезу білка. Найбільш поширеними попередниками для оцінки загального білкового синтезу в радіоавтографічних дослідженнях є 3 H-лейцин, 3 H-метіонін, 3 H-фенілаланін. Наприклад, з використанням лейцинової мітки вивчався синтез загального білка в головному мозку щурів перших тижнів постнатального розвитку (Pavlik, Jakoubek, 1976). Для вивчення синтезу гістонів та їх впливу на регуляцію транскрипції використовують основні амінокислоти 3 H-лізин та 3 H-аргінін, для вивчення синтезу кислих білків - 3 H-триптофан. Щільність включення амінокислотної мітки відповідає інтенсивності синтезу білка, отже відбиває функціональну активність нейрона. Радіоавтографічний метод дозволяє порівнювати особливості синтезу білка у різних тканинах тварин при експериментальному впливі, дозволяє простежити динаміку змін лише на рівні окремих типів клітин та клітинних структур (ядро, тіло клітини, відростки нейрона – аксональний транспорт).
В даний час радіоавтографічний метод часто використовується для вивчення мозку у роботах з використанням радіолігандів до певних рецепторів. Таким чином побудовані карти розподілу різних рецепторів у структурах мозку тварин та людини.
Радіоавтографічний метод також використовується для візуалізації гелів у біохімії та у поєднанні з імунологічними методами (РІА).
Використана література:
1. Єпіфанова О.І. та ін Радіоавтографія М., «Вищ.школа», 1977
2.Саркісов Д.С. Перов Ю.Л. Мікроскопічна техніка М.: "Медицина", 1996
3.Rogers A.W. Практична autoradiography, Amersham UK, 1982
4.Бокштейн С.З. Гінзбург С.С. та ін. Електронно-мікроскопічна авторадіографія у металознавстві М., «Металургія»
Авторадіогр а фія, ауторадіографія, радіоавтографія метод вивчення розподілу радіоактивних речовин у досліджуваному об'єкті накладенням на об'єкт чутливої до радіоактивних випромінювань фотоемульсії Радіоактивні речовини, що містяться в об'єкті, як би самі себе фотографують(Звідси і назва). Методом авторадіографії широко користуються у фізиці та техніці, у біології та медицині – усюди, де застосовуються ізотопні індикатори.
Після прояви та фіксації фотоемульсії на ній виходить зображення, що відображає розподіл, що досліджується. Існує кілька способів застосування фотоемульсії до об'єкта. Фотопластинку можна прямо накласти на відшліфовану поверхню зразка або ж можна наносити на зразок рідку теплу емульсію, яка при застиганні утворює щільно прилеглий до зразка шар і після експозиції і фотообробки досліджується. Розподіл радіоактивних речовин вивчають, порівнюючи щільність почорніння фотоплівки від досліджуваного та еталонного зразка(т.зв. макрорадіографія).
Другий методполягає в підрахунку слідів, що утворюються іонізуючими частинками у фотоемульсії, за допомогою оптичного або електронного мікроскопа (мікрорадіографія). Цей метод значно чутливіший за перший. Для отримання макроавтографів застосовуються діапозитивні та рентгенівські емульсії, для мікроавтографів – спеціальні дрібнозернисті емульсії.
Фотографічне зображення розподілу радіоактивних речовин у об'єкті, що досліджується, отримане методом авторадіографії, називається авторадіограмою, або радіоавтографом.
Введення в організм сполук, мічених радіоізотопами, та подальше дослідження тканин та клітин методом авторадіографії дозволяє:
- отримати точні дані про те, яких саме клітинах або клітинних структурах відбуваються ті чи інші процеси,
- локалізуються ті чи інші речовини,
- встановити часові параметри низки процесів.
Так, наприклад, застосування радіоактивного фосфору та авторадіографії дали можливість виявити присутність інтенсивного обміну речовин у кістці, що росте; застосування радіоіоду та авторадіографії дозволили уточнити закономірності діяльності щитовидної залози; введення мічених сполук - попередників білка та нуклеїнових кислот, та авторадіографія допомогли усвідомити роль в обміні цих життєво важливих сполук певних клітинних структур. Метод авторадіографії дозволяє визначити не тільки локалізацію радіоізотопу в біологічному об'єкті, але і його кількість, оскільки кількість відновлених зерен срібла емульсії пропорційно кількості частинок, що впливають на неї. Кількісний аналізмакроавтографів проводять звичайними прийомами фотометрії, а мікроавтографів - підрахунком під мікроскопом зерен срібла або слідів-треків, що виникли в емульсії під дією іонізуючих частинок. Авторадіографію починають успішно поєднувати з електронною мікроскопією
