Autoradiografija. Radioautografija Autoradiografijos metodas citologijoje
Autoradiografija autoradiografija, radioautografija, radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymo tiriamame objekte tyrimo metodas, uždedant objektą radioaktyviajai spinduliuotei jautria fotografine emulsija. Atrodo, kad objekte esančios radioaktyviosios medžiagos fotografuoja save (iš čia ir kilo pavadinimas). A. metodas plačiai taikomas fizikoje ir technikoje, biologijoje ir medicinoje – visur, kur naudojami izotopų žymekliai. Išryškinus ir fiksavus fotografinę emulsiją, ant jos gaunamas vaizdas, kuriame rodomas tiriamas pasiskirstymas. Yra keletas būdų, kaip objektą užtepti fotografine emulsija. Ant bandinio poliruoto paviršiaus galima tiesiogiai uždėti fotografinę plokštelę arba ant mėginio užtepti šiltą skystą emulsiją, kuri sustingusi suformuoja sluoksnį, glaudžiai besiribojantį su mėginiu ir yra tiriama po ekspozicijos ir nuotraukos apdorojimo. Radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymas tiriamas lyginant bandomojo ir etaloninio mėginio plėvelės juodėjimo tankį (vadinamoji makroradiografija). Antrasis metodas – tai pėdsakų, susidarančių jonizuojant daleles fotografinėje emulsijoje, skaičiavimas naudojant optinį arba elektroninį mikroskopą (mikroradiografija). Šis metodas yra daug jautresnis nei pirmasis. Makroautografams gauti naudojamos skaidrumo ir rentgeno emulsijos, mikroautografams – specialios smulkiagrūdės emulsijos. Fotografinis radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymo tiriamame objekte vaizdas, gautas A. metodu, vadinamas autoradiograma, arba radioautografu. Ant ryžių. 12
ir 3
pateikiami autoradiogramų pavyzdžiai. A. metodu galima nustatyti radioaktyviųjų elementų buvimą įvairiose rūdose, natūralių radioaktyvių elementų pasiskirstymą augalų ir gyvūnų organizmų audiniuose ir kt. Radioaktyviaisiais izotopais paženklintų junginių patekimas į organizmą ir tolesnis audinių bei ląstelių tyrimas A. metodu leidžia gauti tikslius duomenis apie konkrečias ląsteles ar ląstelių struktūras, kuriose vyksta tam tikri procesai, yra lokalizuotos tam tikros medžiagos ir nustatyti daugelio procesų laiko parametrus. Taigi, pavyzdžiui, naudojant radioaktyvųjį fosforą ir A., buvo galima nustatyti, ar augančiame kaule vyksta intensyvus metabolizmas; radioaktyvaus jodo ir A. naudojimas leido išsiaiškinti skydliaukės veiklos dėsningumus; žymėtų junginių – baltymų ir nukleorūgščių pirmtakų – įvedimas, o A. padėjo suprasti tam tikrų ląstelių struktūrų vaidmenį keičiantis šiais gyvybiškai svarbiais junginiais. A. metodas leidžia nustatyti ne tik radioizotopo lokalizaciją biologiniame objekte, bet ir jo kiekį, kadangi sumažintų sidabro grūdelių skaičius emulsijoje yra proporcingas jį veikiančių dalelių skaičiui. Kiekybinė makroautografų analizė atliekama įprastais fotometrijos metodais (žr. Fotometrija) ,
ir mikroautografai – skaičiuojant pro mikroskopą sidabro grūdelius ar pėdsakus, atsiradusius emulsijoje veikiant jonizuojančioms dalelėms. A. pradeda sėkmingai derinti su elektronine mikroskopija (žr. Elektronų mikroskopija). Taip pat žiūrėkite Radiografija. Lit.: Boydas D. A. Autoradiografija biologijoje ir medicinoje, vert. iš anglų k., M., 1957; Zhinkin L. N., Radioaktyviųjų izotopų naudojimas histologijoje, knygoje: Radiotracers in histology, L., 1959, p. 5-33; Perry R., Kiekybinė autoradiografija, Methods in Cell Physiology, 1964, v. Aš, ch. 15, p. 305-26. N. G. Chruščiovas. Ryžiai. 2. Autoradiograma (spauda), rodanti fosforo (32 P) pasiskirstymą pomidorų lapuose. Anksčiau augalas buvo patalpintas į tirpalą, kuriame yra radioaktyvaus fosforo. Šviesios sritys atitinka padidintas radioaktyvaus izotopo koncentracijas; matyti, kad prie stiebo ir kraujagyslinėse lapų dalyse yra susikaupęs fosforas. Ryžiai. 1. Nikelio mėginio mikroradiograma. Tiriama radioaktyviuoju izotopu 113 Sn paženklinto alavo difuzija nikelyje. Radioaktyvaus alavo pasiskirstymas rodo, kad difuzija daugiausia vyksta palei nikelio grūdelių ribas.
Didžioji sovietinė enciklopedija. - M.: Tarybinė enciklopedija. 1969-1978 .
Sinonimai:Pažiūrėkite, kas yra „autoradiografija“ kituose žodynuose:
- (iš auto ... ir radiografijos) radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymo objekte fiksavimo būdas. Ant paviršiaus užtepama (pjaunama) plėvelė su spinduliuotei jautria emulsija. Radioaktyviosios medžiagos tarsi fotografuoja save ... ... Didysis enciklopedinis žodynas
- (radioautografija), radioakto pasiskirstymo matavimo metodas. c c tiriamame objekte (pagal jų pačių spinduliuotę), kurį sudaro branduolinės fotografijos emulsijos sluoksnio uždėjimas ant jo. Pasiskirstymą lemia išsivysčiusio pajuodavimo tankis ... ... Fizinė enciklopedija
Radioaktyviųjų medžiagų (izotopų) pasiskirstymo tiriamame objekte ar junginiuose tyrimo metodas. Tai apima radioaktyviajai spinduliuotei jautrios fotografinės emulsijos uždėjimą ant objekto (arba, pavyzdžiui, chromatogramos) ir atspaudo, ... Mikrobiologijos žodynas
Yra., sinonimų skaičius: 4 autoradiografija (2) makroautoradiografija (1) ... Sinonimų žodynas
Autoradiografija. Žiūrėti radioautografą. (Šaltinis: "Anglų rusų aiškinamasis genetinių terminų žodynas". Arefjevas V.A., Lisovenko L.A., Maskva: VNIRO leidykla, 1995) ... Molekulinė biologija ir genetika. Žodynas.
autoradiografija- Radioakto pasiskirstymo tyrimo metodas. tiriamojo mėginio komponentus savo spinduliuote apkraunant mėginį, jautrų radioaktyviajam veiksmui. emulsinė spinduliuotė. Pasiskirstymą lemia išsivysčiusio pajuodavimo tankis ... ... Techninis vertėjo vadovas
Autoradiografija- * autoradiografija * autoradiografija žr. Genetika. enciklopedinis žodynas
- (iš auto ... ir radiografijos), radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymo objekte registravimo metodas. Ant paviršiaus užtepama (pjaunama) plėvelė su spinduliuotei jautria emulsija. Radioaktyviosios medžiagos tarsi fotografuoja save ... ... enciklopedinis žodynas
Knygos
- Autoradiography in Biology and Medicine, J. Boyd, Knyga priklauso vienam iš autoradiografijos metodo kūrėjų. Pirmieji aštuoni skyriai yra skirti klausimo teorijai. Jie svarsto fotografavimo proceso teoriją, savybes ir ypatybes ... Kategorija: Medicinos žinių pagrindai Leidėjas:
Radijo autografija yra palyginti naujas metodas, nepaprastai išplėtęs šviesos ir elektroninės mikroskopijos galimybes. Tai itin modernus metodas, kurį lemia branduolinės fizikos raida, leidžianti gauti įvairių elementų radioaktyviuosius izotopus. Radioautografijai, visų pirma, tų elementų izotopai, kuriuos naudoja ląstelė arba kurie gali jungtis su ląstelės naudojamomis medžiagomis ir kurie gali būti duodami gyvūnams arba dedami į kultūras tokiais kiekiais, kurie netrukdo normaliam ląstelių metabolizmui. Kadangi radioaktyvusis izotopas (ar juo pažymėta medžiaga) dalyvauja biocheminėse reakcijose taip pat, kaip ir neradioaktyvus jo atitikmuo, ir tuo pat metu skleidžia spinduliuotę, izotopų kelią organizme galima atsekti įvairiais aptikimo metodais. radioaktyvumas. Vienas iš būdų aptikti radioaktyvumą yra pagrįstas jo gebėjimu veikti fotojuostos kaip šviesą; bet radioaktyvioji spinduliuotė prasiskverbia į juodą popierių, naudojamą apsaugoti plėvelę nuo šviesos, ir turi tokį patį poveikį plėvelei kaip ir šviesa.
Kad būtų galima aptikti radioaktyviųjų izotopų skleidžiamą spinduliuotę ant preparatų, skirtų tirti naudojant šviesos ar elektronų mikroskopus, preparatai tamsioje patalpoje padengiami specialia fotografine emulsija, po to kuriam laikui paliekami tamsoje. Tada skaidrės vystomos (taip pat ir tamsoje) ir fiksuojamos. Radioaktyviųjų izotopų turinčios vaisto sritys veikia virš jų esančią emulsiją, kurioje, veikiant skleidžiamai spinduliuotei, atsiranda tamsūs „grūdeliai“. Taigi jie gauna radijo autografus (iš graikų k. radijas- švytintis automobiliai- pats ir grafas- rašyti).
Iš pradžių histologai turėjo tik keletą radioaktyvių izotopų; Pavyzdžiui, daugelyje ankstyvųjų tyrimų, naudojant autoradiografiją, buvo naudojamas radioaktyvusis fosforas. Vėliau buvo panaudota daug daugiau šių izotopų; Ypač plačiai naudojamas radioaktyvusis vandenilio izotopas tritis.
Autoradiografija buvo ir tebėra labai plačiai naudojama tiriant, kur ir kaip organizme vyksta tam tikros biocheminės reakcijos.
Cheminiai junginiai, pažymėti radioaktyviais izotopais, naudojami biologiniams procesams tirti, vadinami pirmtakais. Pirmtakai paprastai yra medžiagos, panašios į tas, kurias organizmas gauna su maistu; jie tarnauja kaip statybiniai blokai audiniams kurti ir yra įtraukiami į sudėtingus ląstelių ir audinių komponentus taip pat, kaip į juos įtraukiami neženklinti statybiniai blokai. Audinio komponentas, į kurį įtrauktas pažymėtas pirmtakas ir kuris skleidžia spinduliuotę, vadinamas produktu.
Kultūroje išaugintos ląstelės, nors ir to paties tipo, bet kuriuo metu bus skirtinguose ląstelių ciklo etapuose, nebent būtų imtasi ypatingo dėmesio jų ciklų sinchronizavimui. Tačiau į ląsteles suleidus tričio-timidino ir po to darant autografus, galima nustatyti įvairių ciklo etapų trukmę. Vienos stadijos – mitozės – pradžios laiką galima nustatyti ir be žymėto timidino. Norėdami tai padaryti, ląstelių mėginys iš kultūros yra stebimas fazinio kontrasto mikroskopu, kuris leidžia tiesiogiai stebėti mitozės eigą ir nustatyti jos laiką. Mitozės trukmė paprastai yra 1 valanda, nors kai kurių tipų ląstelėse ji trunka iki 1,5 valandos.
Radijo autografijos metodas
Radijo autografija, apibrėžimas, istorija.
Autoradiografijos metodas pagrįstas radioaktyviu atomu „pažymėto“ junginio įvedimu į tiriamą objektą ir jo įtraukimo vietos identifikavimu fotografuojant radiacijos registraciją. Vaizdo gavimo pagrindas – radioaktyvaus atomo skilimo metu susidarančių jonizuojančių dalelių poveikis branduolinei fotografinei emulsijai, kurioje yra sidabro halogenido kristalų.
Autoradiografijos metodo atradimas yra tiesiogiai susijęs su radioaktyvumo reiškinio atradimu. 1867 m. buvo paskelbtas pirmasis stebėjimas apie urano druskų poveikį sidabro halogenidams (Niepce de St.Victor). 1896 m. Henry Becquerel stebėjo fotografinės plokštės apšvietimą urano druskomis, prieš tai neveikiant šviesai. Šis eksperimentas laikomas radioaktyvumo reiškinio atradimo momentu. Biologinei medžiagai pritaikytą autoradiografiją pirmą kartą panaudojo Lacassagne ir Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) praėjusio amžiaus 2 dešimtmetyje; histologinis blokas iš įvairių gyvūnų organų po izotopų įvedimo plokščia puse buvo prispaustas prie rentgeno plokštelės ir eksponuojamas. Histologinis pjūvis buvo paruoštas iš anksto ir jai buvo atlikta standartinė dažymo procedūra. Gautas autografas buvo tiriamas atskirai nuo pjūvio. Šis metodas leidžia įvertinti izotopų įtraukimo į biologinį mėginį intensyvumą. 1940-aisiais Leblondas naudojo autoradiografiją, kad parodytų jodo izotopų pasiskirstymą skydliaukės dalyse (Leblond C.P. 1943).
Pirmieji bandymai sujungti autoradiografiją su elektronine mikroskopija buvo atlikti šeštajame dešimtmetyje (Liquir-Milward, 1956). Elektronų mikroskopinė autoradiografija yra ypatingas įprastinės autoradiografijos atvejis, kai taip pat skaičiuojami sidabro grūdeliai ir atsižvelgiama į jų pasiskirstymą. Metodo ypatumas yra labai plono emulsijos sluoksnio naudojimas. Šiuo metu yra pasiekta apie 50 nm skiriamoji geba, kuri yra 10-20 kartų didesnė nei naudojant šviesos mikroskopiją.
Šiuo metu autoradiografijos metodas papildytas galimybe automatiškai įvertinti sidabro grūdelių skaičių naudojant vaizdo analizatorius. Dažnai žymens signalui sustiprinti (paprastai tai yra didelės energijos izotopai) naudojami įvairių tipų scintiliatoriai, nusodinami ant plokštelių (fosforu dengtas intensyvinimo ekranas) arba impregnuojami į emulsiją (PPO) – šiuo atveju. , fotonų emisija apšviečia įprastą fotografinę plokštę arba plėvelę.
Fotografinis vaizdo gavimo principas, fotografinė emulsija
Radiografiniame tyrime branduolinio skilimo detektoriaus vaidmenį atlieka fotografinė emulsija, kurioje, praeinant jonizuojančiai dalelei, lieka latentinis vaizdas, kuris vėliau atskleidžiamas kūrimo metu, panašiai kaip apdorojant įprastą fotografinę juostą.
Fotoemulsija – tai sidabro halogenido mikrokristalų suspensija želatinoje. Mikrokristalai turi struktūrinių defektų, vadinamų jautrumo centrais. Pagal Gurney-Mott modelį, šie kristalo joninės gardelės sutrikimai gali užfiksuoti elektronus, išsiskiriančius alfa arba beta dalelei pereinant per kristalo laidumo juostą, dėl ko jonas paverčiamas atomu. . Gautas latentinis vaizdas gali būti atskleistas atliekant procedūrą, kuri aktyvuotus sidabro halogenido kristalus paverčia metalinio sidabro grūdeliais (šis procesas vadinamas cheminiu vystymu). Kaip ryškalas gali būti naudojamas bet koks pakankamai redukcinis agentas (paprastai fotografuojant ir autoradiografijoje naudojamas metolis, amidolis arba hidrochinonas). Po eksponuotų kristalų poveikio likę sidabro halogenido mikrokristalai iš emulsijos pašalinami fiksatoriumi (dažniausiai hiposulfitu). Branduolinės fotografijos emulsijos pasižymi raiška (grūdėjimu) ir jautrumu. Pirmasis nustatomas pagal sidabro druskos mikrokristalų dydį ir yra atvirkščiai proporcingas pastarajam. Fotografinei emulsijai būdingas sumažėjęs jautrumas matomai šviesai, tačiau dirbti su ja reikia atlikti tamsoje, kad neatsirastų artefaktų.
Emulsiją galima tepti ant vaisto paruoštos plėvelės su substratu pavidalu arba panardinant vaistą į įkaitintą skystą emulsiją – taip gaunamas plonas vienodas sluoksnis, kuris vystomas įprastu būdu. Prieš tepant emulsiją šviesos mikroskopijai, stiklelis dažniausiai nudažomas norimu histologiniu dėme, bet blyškesniu nei įprastai, kad būtų galima suskaičiuoti sidabro grūdelius visose srityse. Vaistas veikia tam tikrą laiką, tada jis sukuriamas.
Autoradiografijoje naudojami izotopai.
Autoradiografijoje, priklausomai nuo tyrimo tikslų ir turimų medžiagų, gali būti naudojami įvairūs izotopai. Jonizuojančios dalelės sukuriamas vaizdas ant branduolinės fotografijos emulsijos priklauso nuo dalelės energijos ir jos sąveikos su medžiaga tipo.
Alfa dalelės, skleidžiamos identiškų radioaktyviųjų branduolių, turi tokią pačią energiją ( E) ir toks pat kelio ilgis ( R) , sujungtas tokiu ryšiu:
R = kE3/2
Kur k – konstanta, apibūdinanti terpę, kurioje dalelės sklinda. Dalelių diapazoną širdyje lemia jos tankis ir elementų sudėtis. Bragg-Klymen ryšys leidžia įvertinti medžiagos, kurios atominė masė A ir tankis, diapazoną pagal alfa dalelių diapazoną ore (R0) d:
R= 0,0003 (R0 / d) A1/2
Kadangi alfa dalelių jonizuojanti galia yra labai didelė, tai palengvina fotografinį izotopų pasiskirstymo registravimą, taip pat leidžia registracijai naudoti ne emulsines medžiagas. Vieno šaltinio skleidžiamas alfa dalelių pėdsakas ant autografų atrodo kaip tiesių, dažniausiai 15–50 mikronų ilgio segmentų spindulys, sklindantis iš vieno taško, leidžiantis tiksliai nustatyti radioaktyviosios etiketės įtraukimo vietą. Tačiau alfa daleles išskiria izotopai, turintys didelį atominį skaičių, o tai riboja jų naudojimą kaip biologinę etiketę.
Alfa dalelių pėdsakai dažnai stebimi histologinėse rentgenogramose kaip artefaktas – stiklelio izotopų savaiminio spinduliavimo rezultatas.
Beta spinduliuotei būdingas nenutrūkstamas dalelių pradinės energijos spektras – nuo nulio iki E max, nustatytas kiekvienam izotopui. Spektro formos labai skiriasi. Taigi labiausiai tikėtina tritemo skleidžiamų dalelių energija yra 1/7 E max, 14C – apie ¼, 32P – apie 1/3. Įvairių izotopų beta spinduliuotės maksimali energija svyruoja nuo 18 keV iki 3,5 MeV – daug platesniame diapazone nei alfa spinduliuotės. Paprastai trumpaamžių izotopų maksimali energija yra didesnė.
Beta dalelių ir monoenergetinių elektronų perėjimą per medžiagą lydi du pagrindiniai sąveikos tipai. Sąveikaujant su orbitoje skriejančiu elektronu, dalelė gali perduoti jam energijos, kurios pakaktų atomui jonizuoti (pašalinti elektroną iš orbitos). Retais atvejais ši energija yra tokia didelė, kad galima stebėti išsilaisvinusio elektrono pėdsaką. Dėl dalelės ir elektrono masių lygybės atsiranda nuokrypis nuo pradinio judėjimo. Antrojo tipo sąveika su atominiais branduoliais sukelia bremsstrahlung rentgeno spindulių atsiradimą. Nors pastarojo emulsija neregistruoja, dalelės sąveikos su branduoliu aktą galima aptikti staigiu trajektorijos lūžiu.
Pakartotinai sąveikaujant su orbitoje skriejančiais elektronais susidaro trajektorijos kreivumas, kuris dažniausiai atrodo kaip vingiuota linija, ypač paskutinėje dalyje, kai mažėja dalelės greitis ir didėja jonizuojanti galia. Trajektorijos ilgis pastebimai viršija atstumą nuo starto iki trasos pabaigos taško – bėgimo. Dėl šios priežasties net ir monoenergetiniams elektronams būdingas šiai spinduliuotei būdingas R max ribojamas diapazonų diapazonas. Dėl mažesnių jonizacijos nuostolių beta daleles aptikti sunkiau nei alfa daleles. Jie nesudaro ištisinių pėdsakų (išskyrus švelniausią tričio spinduliuotę – tačiau šiuo atveju tikimybė, kad praeis daugiau nei vienas emulsijos kristalas yra maža), išsivysčiusių kristalų tankis ir skaičius kinta skirtingose ribose. Beta dalelės diapazoną kitame elemente galima įvertinti pagal formulę:
R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)
Įvairių verčių diapazone E maks didžiausia rida yra susijusi su didžiausia energija pagal ryšį:
R m= 412 E maks 1,265 – 0,0954 lnE maks
Skirtingų energijos dalelių emulsijos kristalų diapazonų, jonizacijos gebėjimų ir tankio skirtumai gali būti naudojami elementų pasiskirstymui atskirti, jei jų izotopai labai skiriasi E max, kaip tričio ir 14C atveju. Dviejų izotopų pasiskirstymo diskriminacija atliekama naudojant du emulsijos sluoksnius ant mėginio, pirmasis sluoksnis registruoja vyraujančią minkštąją spinduliuotę, antrasis – kietą. Remiantis kai kuriais darbais, nuo sukurtų emulsijos kristalų dydžio galima patikimai atskirti skirtingus izotopus – didesnę jonizacijos galią turinčios tričio beta dalelės paveikti kristalai yra didesni.
Vidinės konversijos elektronai susidaro, kai absorbuojamas labai mažos spinduliuotės energijos gama kvantas ir elektronas pašalinamas iš vidinio atomo apvalkalo. Šie elektronai yra panašūs į minkštąsias beta daleles, tačiau skirtingai nuo pastarųjų, yra monoenergetiniai. Vidinių konversijos elektronų buvimas leidžia naudoti izotopus, tokius kaip 125I.
Šiuo metu dažniausiai naudojami izotopai, išskiriantys beta daleles. Paprastai tritis naudojamas ženklinimui histologiniuose tyrimuose. Pirmieji autografai naudojant tritį buvo pagaminti dar šeštajame dešimtmetyje (Fitzgerald ir kt., 1951), tačiau plačiai paplitęs jo naudojimas prasidėjo po to, kai Brookhaven laboratorijoje buvo gautas tričiu pažymėtas timidinas. Kadangi vandenilis yra visų organinių medžiagų dalis, naudojant tritį, galite gauti įvairių junginių, pažymėtų radioaktyvia etikete. Kuo mažesnė skleidžiamos dalelės energija, tuo trumpesnis jos paliekamas takelis judant fotografinėje emulsijoje ir tuo tiksliau galima lokalizuoti pažymėto atomo vietą. Tričio beta dalelių kelio ilgis yra apie 1-2 μm, labiausiai tikėtina energija yra 0,005 MeV, o takelį dažniausiai sudaro vienas sidabro grūdelis, kuris leidžia lokalizuoti spinduliuotės šaltinį ne tik santykinai didelėje ląstelėje. struktūrose, pavyzdžiui, branduolyje, bet ir atskirose chromosomose.
„Paženklintų“ metabolitų patekimas į organizmą leidžia atsekti izotopo įsijungimą į gyvūnų audinių ląsteles, o tai leidžia tirti įvairius biocheminius procesus gyvame organizme.
Gauti absoliučius duomenis – pažymėtos medžiagos koncentracija tiriamame objekte retai kada būna radioautografinių tyrimų tikslas, tam reikia žinoti daugybę sąlygų, kurias sunku nustatyti. Todėl kiekybiniai radioautografiniai tyrimai dažniausiai atliekami lyginant sidabro grūdelių koncentraciją virš tiriamojo objekto ir kontrolinės medžiagos, o kontrolinius duomenis patogu imti kaip vieną, arba 100 proc.
Kai kurių naudojamų izotopų charakteristikos
biologinių objektų radioautografijoje
Radijo autografijos metodas
Radijo autografija, apibrėžimas, istorija.
Autoradiografijos metodas pagrįstas radioaktyviu atomu „pažymėto“ junginio įvedimu į tiriamą objektą ir jo įtraukimo vietos identifikavimu fotografuojant radiacijos registraciją. Vaizdo gavimo pagrindas – radioaktyvaus atomo skilimo metu susidarančių jonizuojančių dalelių poveikis branduolinei fotografinei emulsijai, kurioje yra sidabro halogenido kristalų.
Autoradiografijos metodo atradimas yra tiesiogiai susijęs su radioaktyvumo reiškinio atradimu. 1867 m. buvo paskelbtas pirmasis stebėjimas apie urano druskų poveikį sidabro halogenidams (Niepce de St.Victor). 1896 m. Henry Becquerel stebėjo fotografinės plokštės apšvietimą urano druskomis, prieš tai neveikiant šviesai. Šis eksperimentas laikomas radioaktyvumo reiškinio atradimo momentu. Biologinei medžiagai pritaikytą autoradiografiją pirmą kartą panaudojo Lacassagne ir Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) praėjusio amžiaus 2 dešimtmetyje; histologinis blokas iš įvairių gyvūnų organų po izotopų įvedimo plokščia puse buvo prispaustas prie rentgeno plokštelės ir eksponuojamas. Histologinis pjūvis buvo paruoštas iš anksto ir jai buvo atlikta standartinė dažymo procedūra. Gautas autografas buvo tiriamas atskirai nuo pjūvio. Šis metodas leidžia įvertinti izotopų įtraukimo į biologinį mėginį intensyvumą. 1940-aisiais Leblondas naudojo autoradiografiją, kad parodytų jodo izotopų pasiskirstymą skydliaukės dalyse (Leblond C.P. 1943).
Pirmieji bandymai sujungti autoradiografiją su elektronine mikroskopija buvo atlikti šeštajame dešimtmetyje (Liquir-Milward, 1956). Elektronų mikroskopinė autoradiografija yra ypatingas įprastinės autoradiografijos atvejis, kai taip pat skaičiuojami sidabro grūdeliai ir atsižvelgiama į jų pasiskirstymą. Metodo ypatumas yra labai plono emulsijos sluoksnio naudojimas. Šiuo metu yra pasiekta apie 50 nm skiriamoji geba, kuri yra 10-20 kartų didesnė nei naudojant šviesos mikroskopiją.
Šiuo metu autoradiografijos metodas papildytas galimybe automatiškai įvertinti sidabro grūdelių skaičių naudojant vaizdo analizatorius. Dažnai žymens signalui sustiprinti (paprastai tai yra didelės energijos izotopai) naudojami įvairių tipų scintiliatoriai, nusodinami ant plokštelių (fosforu dengtas intensyvinimo ekranas) arba impregnuojami į emulsiją (PPO) – šiuo atveju. , fotonų emisija apšviečia įprastą fotografinę plokštę arba plėvelę.
Fotografinis vaizdo gavimo principas, fotografinė emulsija
Radiografiniame tyrime branduolinio skilimo detektoriaus vaidmenį atlieka fotografinė emulsija, kurioje, praeinant jonizuojančiai dalelei, lieka latentinis vaizdas, kuris vėliau atskleidžiamas kūrimo metu, panašiai kaip apdorojant įprastą fotografinę juostą.
Fotoemulsija – tai sidabro halogenido mikrokristalų suspensija želatinoje. Mikrokristalai turi struktūrinių defektų, vadinamų jautrumo centrais. Pagal Gurney-Mott modelį, šie kristalo joninės gardelės sutrikimai gali užfiksuoti elektronus, išsiskiriančius alfa arba beta dalelei pereinant per kristalo laidumo juostą, dėl ko jonas paverčiamas atomu. . Gautas latentinis vaizdas gali būti atskleistas atliekant procedūrą, kuri aktyvuotus sidabro halogenido kristalus paverčia metalinio sidabro grūdeliais (šis procesas vadinamas cheminiu vystymu). Kaip ryškalas gali būti naudojamas bet koks pakankamai redukcinis agentas (paprastai fotografuojant ir autoradiografijoje naudojamas metolis, amidolis arba hidrochinonas). Po eksponuotų kristalų poveikio likę sidabro halogenido mikrokristalai iš emulsijos pašalinami fiksatoriumi (dažniausiai hiposulfitu). Branduolinės fotografijos emulsijos pasižymi raiška (grūdėjimu) ir jautrumu. Pirmasis nustatomas pagal sidabro druskos mikrokristalų dydį ir yra atvirkščiai proporcingas pastarajam. Fotografinei emulsijai būdingas sumažėjęs jautrumas matomai šviesai, tačiau dirbti su ja reikia atlikti tamsoje, kad neatsirastų artefaktų.
Emulsiją galima tepti ant vaisto paruoštos plėvelės su substratu pavidalu arba panardinant vaistą į įkaitintą skystą emulsiją – taip gaunamas plonas vienodas sluoksnis, kuris vystomas įprastu būdu. Prieš tepant emulsiją šviesos mikroskopijai, stiklelis dažniausiai nudažomas norimu histologiniu dėme, bet blyškesniu nei įprastai, kad būtų galima suskaičiuoti sidabro grūdelius visose srityse. Vaistas veikia tam tikrą laiką, tada jis sukuriamas.
Autoradiografijoje naudojami izotopai.
Autoradiografijoje, priklausomai nuo tyrimo tikslų ir turimų medžiagų, gali būti naudojami įvairūs izotopai. Jonizuojančios dalelės sukuriamas vaizdas ant branduolinės fotografijos emulsijos priklauso nuo dalelės energijos ir jos sąveikos su medžiaga tipo.
Alfa dalelės, skleidžiamos identiškų radioaktyviųjų branduolių, turi tokią pačią energiją ( E) ir toks pat kelio ilgis ( R) , sujungtas tokiu ryšiu:
R = kE 3/2
Kur k – konstanta, apibūdinanti terpę, kurioje dalelės sklinda. Dalelių diapazoną širdyje lemia jos tankis ir elementų sudėtis. Bragg-Klymen ryšys leidžia pagal alfa dalelių diapazoną ore (R 0) įvertinti diapazoną medžiagoje, kurios atominė masė A ir tankis d:
R= 0,0003 (R0 / d) A 1/2
Kadangi alfa dalelių jonizuojanti galia yra labai didelė, tai palengvina fotografinį izotopų pasiskirstymo registravimą, taip pat leidžia registracijai naudoti ne emulsines medžiagas. Vieno šaltinio skleidžiamas alfa dalelių pėdsakas ant autografų atrodo kaip tiesių, dažniausiai 15–50 mikronų ilgio segmentų spindulys, sklindantis iš vieno taško, leidžiantis tiksliai nustatyti radioaktyviosios etiketės įtraukimo vietą. Tačiau alfa daleles išskiria izotopai, turintys didelį atominį skaičių, o tai riboja jų naudojimą kaip biologinę etiketę.
Alfa dalelių pėdsakai dažnai stebimi histologinėse rentgenogramose kaip artefaktas – stiklelio izotopų savaiminio spinduliavimo rezultatas.
Beta dalelių ir monoenergetinių elektronų perėjimą per medžiagą lydi du pagrindiniai sąveikos tipai. Sąveikaujant su orbitoje skriejančiu elektronu, dalelė gali perduoti jam energijos, kurios pakaktų atomui jonizuoti (pašalinti elektroną iš orbitos). Retais atvejais ši energija yra tokia didelė, kad galima stebėti išsilaisvinusio elektrono pėdsaką. Dėl dalelės ir elektrono masių lygybės atsiranda nuokrypis nuo pradinio judėjimo. Antrojo tipo sąveika su atominiais branduoliais sukelia bremsstrahlung rentgeno spindulių atsiradimą. Nors pastarojo emulsija neregistruoja, dalelės sąveikos su branduoliu aktą galima aptikti staigiu trajektorijos lūžiu.
Pakartotinai sąveikaujant su orbitoje skriejančiais elektronais susidaro trajektorijos kreivumas, kuris dažniausiai atrodo kaip vingiuota linija, ypač paskutinėje dalyje, kai mažėja dalelės greitis ir didėja jonizuojanti galia. Trajektorijos ilgis pastebimai viršija atstumą nuo starto iki trasos pabaigos taško – bėgimo. Dėl šios priežasties net ir monoenergetiniams elektronams būdingas šiai spinduliuotei būdingas R max ribojamas diapazonų diapazonas. Dėl mažesnių jonizacijos nuostolių beta daleles aptikti sunkiau nei alfa daleles. Jie nesudaro ištisinių pėdsakų (išskyrus švelniausią tričio spinduliuotę – tačiau šiuo atveju tikimybė, kad praeis daugiau nei vienas emulsijos kristalas yra maža), išsivysčiusių kristalų tankis ir skaičius kinta skirtingose ribose. Beta dalelės diapazoną kitame elemente galima įvertinti pagal formulę:
R = R A1 (Z/A) A1 / (Z/A)
Įvairių verčių diapazone E maks didžiausia rida yra susijusi su didžiausia energija pagal ryšį:
R m= 412 E maks 1,265 – 0,0954 lnE maks
Skirtingų energijos dalelių emulsijos kristalų diapazonų, jonizacijos gebėjimų ir tankio skirtumai gali būti naudojami elementų pasiskirstymui atskirti, jei jų izotopai labai skiriasi E max, kaip tričio ir 14 C atveju. dviejų izotopų pasiskirstymas atliekamas užtepus ant dviejų emulsijos sluoksnių mėginio, pirmasis sluoksnis registruoja vyraujančią minkštąją spinduliuotę, antrasis – kietą. Remiantis kai kuriais darbais, nuo sukurtų emulsijos kristalų dydžio galima patikimai atskirti skirtingus izotopus – didesnę jonizacijos galią turinčios tričio beta dalelės paveikti kristalai yra didesni.
Vidinės konversijos elektronai susidaro, kai absorbuojamas labai mažos spinduliuotės energijos gama kvantas ir elektronas pašalinamas iš vidinio atomo apvalkalo. Šie elektronai yra panašūs į minkštąsias beta daleles, tačiau skirtingai nuo pastarųjų, yra monoenergetiniai. Vidinių konversijos elektronų buvimas leidžia naudoti izotopus, tokius kaip 125 I.
Šiuo metu dažniausiai naudojami izotopai, išskiriantys beta daleles. Paprastai tritis naudojamas ženklinimui histologiniuose tyrimuose. Pirmieji autografai naudojant tritį buvo pagaminti dar šeštajame dešimtmetyje (Fitzgerald ir kt., 1951), tačiau plačiai paplitęs jo naudojimas prasidėjo po to, kai Brookhaven laboratorijoje buvo gautas tričiu pažymėtas timidinas. Kadangi vandenilis yra visų organinių medžiagų dalis, naudojant tritį, galite gauti įvairių junginių, pažymėtų radioaktyvia etikete. Kuo mažesnė skleidžiamos dalelės energija, tuo trumpesnis jos paliekamas takelis judant fotografinėje emulsijoje ir tuo tiksliau galima lokalizuoti pažymėto atomo vietą. Tričio beta dalelių kelio ilgis yra apie 1-2 μm, labiausiai tikėtina energija yra 0,005 MeV, o takelį dažniausiai sudaro vienas sidabro grūdelis, kuris leidžia lokalizuoti spinduliuotės šaltinį ne tik santykinai didelėje ląstelėje. struktūrose, pavyzdžiui, branduolyje, bet ir atskirose chromosomose.
„Paženklintų“ metabolitų patekimas į organizmą leidžia atsekti izotopo įsijungimą į gyvūnų audinių ląsteles, o tai leidžia tirti įvairius biocheminius procesus gyvame organizme.
Gauti absoliučius duomenis – pažymėtos medžiagos koncentracija tiriamame objekte retai kada būna radioautografinių tyrimų tikslas, tam reikia žinoti daugybę sąlygų, kurias sunku nustatyti. Todėl kiekybiniai radioautografiniai tyrimai dažniausiai atliekami lyginant sidabro grūdelių koncentraciją virš tiriamojo objekto ir kontrolinės medžiagos, o kontrolinius duomenis patogu imti kaip vieną, arba 100 proc.
Kai kurių naudojamų izotopų charakteristikos
biologinių objektų radioautografijoje
Radioaktyvaus fosforo beta dalelės branduolinėje emulsijoje gali nuskristi iki kelių milimetrų atstumu, takelį sudaro dešimtys retai esančių sidabro dalelių – pavyzdžiui, radioaktyvusis fosforas gali būti naudojamas tik tiriant izotopo pasiskirstymą audiniuose. , negalima nustatyti lokalizacijos atskirose ląstelių struktūrose.
Radioaktyvioji siera ir anglis gali būti naudojamos lokalizuoti izotopą atskirose ląstelėse, jei jie yra dideli arba pakankamai nutolę vienas nuo kito, o tai galima pasiekti kraujo tepinėliuose arba ląstelių suspensijose.
Rezoliucijos ir metodų klaidos, metodų klaidos.
geometrinė klaida– dėl to, kad skleidžiama dalelė gali būti nukreipta bet kokiu kampu į fotosluoksnio paviršių. Vadinasi, sidabro grūdeliai fotosluoksnyje gali būti ne tiksliai virš radioaktyvaus atomo, o daugiau ar mažiau pasislinkę, priklausomai nuo dalelių judėjimo krypties ir kelio ilgio (energijos).
nuotraukų klaida atsiranda dėl to, kad sidabro grūdelis, susidedantis iš tūkstančių metalo atomų, yra daug didesnis už radioaktyvųjį atomą. Taigi, mažesnio objekto lokalizacija turi būti vertinama pagal didesnio objekto padėtį.
Naudojant tritį, kuriam būdinga maža skleidžiamų dalelių energija (rida) ir mažo grūdėtumo branduolines fotografijos emulsijas, autoradiografijos metodo skiriamoji geba patenka į optinių sistemų skiriamąją gebą – 1 μm. Taigi šios klaidos rezultatui didelės įtakos neturi.
Norint pasiekti geresnę skiriamąją gebą, reikia sumažinti pjūvio storį, emulsijos sluoksnį ir atstumą tarp jų. Mėginys turi būti šiek tiek per mažai eksponuotas.
Automatinis absorbcijos efektas: Sidabro grūdelių skaičius priklauso nuo ląstelių struktūrų spinduliuotės sugerties laipsnio, dėl mažo beta dalelių diapazono ir mažos energijos jų absorbcija audiniuose yra gana didelė, todėl gali būti prarasta žymė, todėl kyla klausimas svarbus tampa sekcijų storis. Įrodyta, kad sidabro grūdelių skaičius proporcingas audinių radioaktyvumui tik esant ne didesniam kaip 5 mikronų pjūvio storiui.
Santykinis beta dalelių, kurios storiu praėjo per absorberio sluoksnį, skaičius X galima įvertinti pagal Baerio dėsnį -
N x/N 0 = e - m x
kur m yra sugerties koeficientas (sluoksnio storio, kuriam praeinant dalelių skaičius mažėja, atvirkštinė vertė e kartą. Absorbcijos koeficiento reikšmę galima apytiksliai įvertinti pagal R reikšmę m(maksimalus diapazonas), žinomas visiems izotopams, naudojant santykį m R m= 10, kuris galioja ne per stipriai spinduliuotei.
Jei vienetinio storio sluoksnyje per laiko vienetą link paviršiaus juda n dalelių, tai mėginyje, kurio storis X paviršius pasieks N dalelių:
Fonas ir artefaktai: Matavimų paklaida gali atsirasti ir dėl mechaninių poveikių – įbrėžimų, emulsijos įtrūkimų, dėl kurių susidaro latentinis vaizdas ir foninė spinduliuotė, į kurią reikia atsižvelgti apdorojant autografus. Į foną atsižvelgiama skaičiuojant sidabro grūdelių skaičių tuščiame preparato plote. Klaidos taip pat atsiranda dėl sekcijų histologinio apdorojimo - alkoholių prijungimo (dehidratacijos), parafino įterpimo, dažymo. Šios procedūros gali paveikti ląstelių struktūrų dydį ir santykį.
Pažymėtų metabolitų spinduliuotės poveikis: Dėl mažos spinduliuotės energijos tritis sukelia didelę jonizaciją ląstelėje, daug didesnę nei anglies beta dalelių spinduliavimo poveikis. Dėl to, ilgai veikiant žymėtam junginiui, pavyzdžiui, 3H-timidinui, ląstelės sunaikinamos ir miršta, o tai sustabdo audinių augimą. Visų pirma, sutrinka spermatogenezė. Yra mutageninio ir kancerogeninio žymėtų metabolitų poveikio įrodymų. Pastebėti citologiniai pokyčiai susideda iš ląstelių mitozinio ciklo sutrikimo, ląstelių ploidijos pokyčių ir chromosomų aberacijų atsiradimo. Tačiau, matyt, žalingas izotopo poveikis ląstelėms gali pastebimai paveikti tyrimo rezultatus tik ilgo eksperimento sąlygomis.
Radioaktyvumo kiekybinis nustatymas
Paprastai eksperimente nustatomas ne absoliutus, o santykinis įtraukto izotopo kiekis. Etiketės įtraukimo laipsnis gali būti įvertintas dviem būdais – densitometriniu būdu – tai labiau taikoma makroautografams ir tiesioginiam sidabro grūdelių skaičiavimui virš objektų. Šiuo metu šią daug laiko reikalaujančią procedūrą galima atlikti naudojant kompiuterį. Skaitmeninis histologinio preparato vaizdas apdorojamas specialia programine įranga, siekiant automatiškai išryškinti jame esančias ląsteles ir ląstelines struktūras bei suskaičiuoti sidabro grūdelių skaičių. Jei iškyla kiekybinio vertinimo klausimas, būtina įtraukti efektyvumo sąvoką. Dažniausiai efektyvumas suprantamas kaip sidabro grūdelių skaičius, susidaręs registruojant vieną radioaktyvų skilimą. Metodo efektyvumą įtakoja daug veiksnių, pirmiausia objekto ir emulsijos storis.
Atliekant tyrimus, kuriuose buvo naudojamas scintiliacijos skaitiklis, nustatyta didelė koreliacija tarp vidutinio skilimų skaičiaus per minutę ir sidabro grūdelių skaičiaus. Hunt (Hunt and Foote, 1967) teigimu, vieno grūdelio susidarymas eksperimente naudotoje emulsijoje atitinka 5,8 radioaktyvaus skilimo, t.y., metodo efektyvumas yra 17,8%.
Tričio kiekiui makroskopiniuose preparatuose nustatyti gali būti naudojami standartinio aktyvumo mėginiai, pritvirtinti prie to paties autografo.
Tiksliai įvertinti lyginamų biologinių objektų radioaktyvumą yra labai sunku.
Klasikinis radioautografinio tyrimo pavyzdys yra darbas apie 32 P kaupimąsi arklio pupelių šaknų ląstelių DNR (Howard ir Pelc, 1953). Šiame eksperimente pirmą kartą buvo parodytas mitozinio ciklo padalijimas į keturis periodus (mitozė – M, G 1 – presintetinis periodas, S – DNR sintezė, premitozinis periodas G 2), kad DNR sintezės periodas užima ribotą laiką. tarpfazės dalis, laike atskirta nuo mitozės pradžios ir pabaigos. Howardo ir Pelko duomenys vėliau buvo patvirtinti atliekant tikslesnius eksperimentus, naudojant specifinį DNR pirmtaką 3H-timidiną.
Baltymų sintezės vertinimo metodai. Labiausiai paplitę pirmtakai vertinant bendrą baltymų sintezę radioautografiniuose tyrimuose yra 3H-leucinas, 3H-metioninas, 3H-fenilalaninas. Pavyzdžiui, viso baltymo sintezė žiurkių smegenyse pirmosiomis postnatalinio vystymosi savaitėmis buvo tiriama naudojant leucino etiketę (Pavlik ir Jakoubek, 1976). Histonų sintezei ir jų poveikiui transkripcijos reguliavimui tirti naudojamos bazinės aminorūgštys 3H-lizinas ir 3H-argininas, o rūgštinių baltymų sintezei tirti – 3H-triptofanas. Aminorūgščių etiketės įtraukimo tankis atitinka baltymų sintezės intensyvumą, todėl atspindi neurono funkcinį aktyvumą. Radioautografinis metodas leidžia palyginti baltymų sintezės ypatumus įvairiuose gyvūnų audiniuose eksperimentinio poveikio metu ir leidžia atsekti pokyčių dinamiką atskirų ląstelių tipų ir ląstelių struktūrų (branduolio, ląstelės kūno, neuronų procesų – aksoninių) lygyje. transportas).
Šiuo metu autoradiografija dažnai naudojama smegenų tyrimui atliekant tyrimus, kuriuose naudojami tam tikrų receptorių radioligandai. Taip buvo sudaryti įvairių receptorių pasiskirstymo gyvūnų ir žmonių smegenų struktūrose žemėlapiai.
Autoradiografija taip pat naudojama vizualizuoti geles biochemijoje ir kartu su imunologiniais tyrimais (RIA).
Nuorodos:
1. Epifanova O.I. ir kt. Radijo autografas M., Aukštoji mokykla, 1977 m
2. Sarkisovas D.S. Perovas Yu.L. Mikroskopinė technika M.: „Medicina“, 1996 m
3. Rogers A.W. Praktinė autoradiografija, Amersham UK, 1982 m
4. Bokšteinas S.Z. Ginzburg S.S. ir kt. Elektronmikroskopinė autoradiografija metalo moksle M., "Metalurgija"
Autoradiograma a fiya, autoradiografija, autoradiografija , radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymo tiriamame objekte tyrimo metodas, uždedant objektą radioaktyviajai spinduliuotei jautria fotografine emulsija. Objekte esančios radioaktyviosios medžiagos fotografuoti save(iš čia ir pavadinimas). Autoradiografijos metodas plačiai taikomas fizikoje ir technikoje, biologijoje ir medicinoje, visur, kur naudojami izotopų žymekliai.
Išryškinus ir fiksavus fotografinę emulsiją, ant jos gaunamas vaizdas, kuriame rodomas tiriamas pasiskirstymas. Yra keletas būdų, kaip objektą užtepti fotografine emulsija. Ant bandinio poliruoto paviršiaus galima tiesiogiai uždėti fotografinę plokštelę arba ant mėginio užtepti šiltą skystą emulsiją, kuri sustingusi suformuoja sluoksnį, glaudžiai besiribojantį su mėginiu ir yra tiriama po ekspozicijos ir nuotraukos apdorojimo. Radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymas tiriamas lyginant bandomojo ir etaloninio mėginio plėvelės juodėjimo tankis(vadinamoji makroradiografija).
Antrasis metodas susideda iš pėdsakų, susidarančių jonizuojančių dalelių fotografinėje emulsijoje, skaičiavimas, naudojant optinis arba elektroninis mikroskopas (mikroradiografija). Šis metodas yra daug jautresnis nei pirmasis. Makroautografams gauti naudojamos skaidrumo ir rentgeno emulsijos, mikroautografams – specialios smulkiagrūdės emulsijos.
Radioaktyviųjų medžiagų pasiskirstymo tiriamame objekte fotografinis vaizdas, gautas autoradiografijos būdu, vadinamas autoradiograma arba radioautografas.
Radioizotopais paženklintų junginių patekimas į organizmą ir tolesnis audinių bei ląstelių tyrimas autoradiografijos būdu leidžia:
- gauti tikslios informacijos apie kurie ląstelės arba ląstelių struktūrose, vyksta tam tikri procesai,
- lokalizuotos medžiagos,
- nustatyti daugelio procesų laiko parametrus.
Pavyzdžiui, naudojant radioaktyvųjį fosforą ir autoradiografiją, buvo galima nustatyti intensyvaus metabolizmo buvimą augančiame kaule; radioaktyvaus jodo ir autoradiografijos naudojimas leido išsiaiškinti skydliaukės veiklos modelius; žymėtų junginių – baltymų ir nukleorūgščių pirmtakų – įvedimas, o autoradiografija padėjo išsiaiškinti tam tikrų ląstelių struktūrų vaidmenį šių gyvybiškai svarbių junginių mainuose. Autoradiografijos metodas leidžia nustatyti ne tik radioizotopo lokalizaciją biologiniame objekte, bet ir jo kiekį, nes emulsijos sumažintų sidabro grūdelių skaičius yra proporcingas jį veikiančių dalelių skaičiui. Kiekybinė analizė makroautografai atliekami įprastais fotometrijos metodais, o mikroautografai – mikroskopu skaičiuojant sidabro grūdelius ar pėdsakus, atsiradusius emulsijoje veikiant jonizuojančioms dalelėms. Autoradiografija pradedama sėkmingai derinti su elektronine mikroskopija
