Дипломная работа антиоксидантные свойства дигидрокверцетина. Фундаментальные исследования Текст научной работы на тему «Хемилюминесцентная методика определения общей антиоксидантной емкости в лекарственном растительном сырье»
Нажав на кнопку "Скачать архив", вы скачаете нужный вам файл совершенно бесплатно.
Перед скачиванием данного файла вспомните о тех хороших рефератах, контрольных, курсовых, дипломных работах, статьях и других документах, которые лежат невостребованными в вашем компьютере. Это ваш труд, он должен участвовать в развитии общества и приносить пользу людям. Найдите эти работы и отправьте в базу знаний.
Мы и все студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будем вам очень благодарны.
Чтобы скачать архив с документом, в поле, расположенное ниже, впишите пятизначное число и нажмите кнопку "Скачать архив"
Подобные документы
Исследование ферментативных и неферментативных путей образования активных форм кислорода. Механизмы их повреждающего воздействия на живые клетки, в частности, инициация свободнорадикального перекисного окисления липидов. Антиоксидантная защита организма.
курсовая работа , добавлен 11.01.2017
Антиоксидантная активность растительных материалов. Описание растений, обладающих антиоксидантной активностью. Определение содержания витамина С в калине обыкновенной в период созревания, содержания полифенольных соединений в различных сортах чая.
дипломная работа , добавлен 02.04.2009
Гиббереллины - обширный класс фитогормонов, регулирующих рост и развитие: история открытия, химическая структура, классификация, содержание в растениях. Биохимия, регуляторные функции и биологическая активность гиббереллинов, их строение, свойства.
презентация , добавлен 20.10.2014
реферат , добавлен 19.05.2017
Биологическая активность и химическая структура брассиностероидов. Синтезы с сохранением углеродного скелета. Формирование функций характерных для циклической части брассиностероидов. Построение боковой цепи с образованием новых углерод-углеродных связей.
курсовая работа , добавлен 07.12.2014
Исследование физиологии поджелудочной железы, роли панкреатического сока в процессе пищеварения. Анализ активных форм кислорода и путей их образования, биохимии свободно-радикальных процессов. Обзор состояния обменных процессов при остром панкреатите.
курсовая работа , добавлен 10.03.2012
Химический состав рода Penstemon и биологическая активность. Качественный фитохимический анализ растительного сырья методом тонкослойной хроматографии. Определение количественного состава компонентов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
практическая работа , добавлен 07.01.2016
АнтиОксиданты (АО) - вещества, препятствующие окислению. В живом организме ведущим фактором окисления является образование свободных радикалов, поэтому действие антиоксидантов в биологических системах рассматривается преимущественно с позиции предотвращения окисления органических веществ свободными радикалами.
В настоящее время существует большое количество различных методов определения антиоксидантов: фотометрические, химические, электрохимические и др. Однако, многие из них имеют существенные недостатки, затрудняющие понимание и дальнейшее использование результатов, полученных этими методами. К наиболее часто встречающимся недостаткам можно отнести следующие:
- Используются искусственные или нехарактерные для биологических систем условия измерения антиоксидантного действия. Например, вместо биологических свободно-радикальных реакций используются чисто химические окислительно-восстановительные реакции или осуществляется измерение способности вещества отдавать/принимать электроны при воздействии электрическим током. Результаты измерений, полученные в таких условиях, не позволяют говорить о том, исследуемое вещество будет проявлять такое же "антиоксидантное" действие в организме.
- Определение антиоксидантного действия осуществляется путем измерения количества накопленных продуктов окисления (маркеров окисления). Таким образом действительно можно определить количество антиоксиданта в исследуемом образце, но упускается весьма важная информация об активности антиоксиданта. Игнорирование активности антиоксиданта в свою очередь может приводить к существенным ошибкам в определении его количества, например, для "слабых" антиоксидантов, которые действуют медленно, но в течение длительного времени.
Хемилюминесцентный метод является наиболее информативным методом исследования антиоксидантов и обладает рядом существенных преимуществ:
- Прямое определение антиоксидантного действия
- регистрируется непосредственное действие антиоксидантов на свободные радикалы.
В хемилюминесцентном методе используется химическая система генерации свободных радикалов, которая дает контрольное хемилюминесцентное свечение.
Затем к такой системе добавляется антиоксидант, который нейтрализует свободные радикалы, что приводит к подавлению контрольной хемилюминесценции.
Значительным достоинством такого подхода является возможность использования различных химических систем генерации свободных радикалов, что позволяет дополнительно определять специфичность антиоксидантов и локализацию их действия. - Измерение количественных и качественных характеристик антиоксидантов
- хемилюминесцентный метод позволяет охарактеризовать
любое соединение, обладающее антиоксидантным действием, двумя независимыми показателями:
- АнтиОксидантная Емкость (АОE) - общее количество свободных радикалов, которое может нейтрализовать соединение, содержащееся в пробе определенного объема.
- АнтиОксидантная Активность (АОА) - скорость нейтрализации свободных радикалов, т.е. количество радикалов, нейтрализуемых в единицу времени.
Хемилюминесцентный метод
дает важное понимание того,
что действие антиоксидантов обязательно должно оцениваться двумя показателями - количественным (AOE) и качественным (AOA).
Следующий рисунок демонстрирует это положение:
Влияние разных антиоксидантов на хемилюминесценцию
(цифрами возле графиков указана концентрация антиоксиданта):
слева – "сильный" антиоксидант, справа – "слабый" антиоксидант.
Антиоксиданты существенно отличаются своей активностью. Существуют "сильные" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с высокой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с высокой скоростью и полностью подавляют хемилюминесценцию. Такие антиоксиданты оказывают максимальный эффект уже при малых концентрациях и быстро расходуются. С другой стороны существуют "слабые" антиоксиданты, т.е. антиоксиданты с низкой активностью, которые ингибируют свободные радикалы с низкой скоростью и подавляют хемилюминесценцию лишь частично. Значимый эффект такие антиоксиданты оказывают только в больших концентрациях, но при этом они медленно расходуются и действуют в течение длительного времени.
Хемилюминесцентный метод может применяться для определения антиоксидантных показателей:
- биологических жидкостей (плазма, слюна, моча);
- фармакологических препаратов и биологически активных добавок;
- напитков и пищевых добавок;
- косметических средств и средств для ухода;
- и др.
- Хемилюминометр Lum-100 - обеспечивает термостатирование и регистрацию хемилюминесценции 1 пробы.
- Хемилюминометр Lum-1200 - обеспечивает термостатирование и одновременную регистрацию хемилюминесценции до 12 проб.
Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при определении суммарной антиоксидантной активности. Способ осуществляют следующим образом: аналит взаимодействует с реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин. Аскорбиновая кислота (АК) взаимодействует с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100. Далее инкубируют не менее 90 мин и фотометрируют при 510±20 нм. После этого устанавливают зависимость величины аналитического сигнала от количества вещества и расчитывают величину суммарной АОА. Представленный способ позволяет менее трудоемко и более достоверно определять суммарную антиоксидантную активность растительного сырья и пищевых продуктов на его основе. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл.
Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано при определении суммарной антиоксидантной активности (АОА) растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.
Известен кулонометрический способ определения суммарной АОА чая, основанный на взаимодействии водных экстрактов продукта с электрогенерируемыми соединениями брома (И.Ф.Абдулин, Е.Н.Турова, Г.К.Будников Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерируемым бромом // Журн. аналит. химии. 2001. Т.56. № 6. С.627-629). Выбор в качестве титранта электрогенерированных соединений брома обусловлен их способностью вступать в различные реакции: радикальные, окислительно-восстановительные, электрофильного замещения и присоединения по кратным связям. Это позволяет охватить широкий круг биологически активных соединений чая, обладающих антиоксидантными свойствами. Недостатками способа являются возможность протекания реакции бромирования с веществами, не являющимися антиоксидантами, и выражение получаемой величины суммарной АОА в единицах количества электричества (кКл/100 г), что затрудняет оценку получаемых результатов.
Известен вольтамперометрический способ определения суммарной антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0,0 до -0,6 В (отн. насыщ. х.с.э.) на ртутно-пленочном электроде (Пат. 2224997, Россия, МПК 7 G 01 N 33/01. Вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов / Короткова Е.И., Карбаинов Ю.А. - № 2002115232/12; заявл. 06.06.2002; опубл. 27.02.2004). Недостаток способа - в протекании побочных электрохимических реакций, в результате которых снижается эффективность определения антиоксидантов, что ведет к снижению достоверности результатов.
Известен способ контроля суммарной АОА профилактических и лечебных антиоксидантных средств по перекисному окислению липидов до малонового альдегида с спектрофотометрическим или хемилюминесцентным детектированием (Пат. 2182706, Россия, МПК 7 G 01 N 33/15, 33/52. Способ контроля антиокислительной активности профилактических и лечебных антиоксидантных средств / Павлюченко И.И., Басов А.А., Федосов С.Р. - № 2001101389/14; заявл. 15.01.2001; опубл. 20.05.2002). При этом антиоксидантная активность обратно пропорциональна уровню продуктов перекисного окисления липидов. Недостатком данного способа можно считать ограниченный круг анализируемых объектов, так как в данных условиях определяются антиоксиданты только одной группы - липиды.
Известен способ определения суммарной АОА экстракта растений, заключающийся в инкубации экстракта с линетолом и сульфатом железа (II), инициировании реакции окисления УФ-облучением и последующем взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой в присутствии тритона Х-100 (Заявка 97111917/13, Россия, МПК 6 G 01 N 33/00. Способ определения общей антиокислительной активности / Рогожин В.В. - Заявл. 08.07.1997; опубл. 10.06.1999). При проведении спектрофотометрирования используется смесь этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Значение АОА биологического материала определяют по отношению накопления продукта реакции - малонового диальдегида в пробе, содержащей экстракт, к пробе с прооксидантом. Недостаток способа заключается в возможности протекания побочных реакций при УФ-облучении, что снижает достоверность получаемых результатов анализа.
Перечисленные способы определения суммарной АОА имеют ряд недостатков: высокая трудоемкость, малая достоверность, измеренная величина суммарной АОА не отнесена и не сравнима с каким-либо общепринятым веществом.
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является способ определения суммарной АОА лекарственных растений измерением хемилюминесценции, возникающей при реакции с люминолом в присутствии окислителя пероксида водорода (М.Х.Навас, А.М.Химинец, А.Г.Асуэро Определение восстановительной способности настоек семени канарского канареечника методом хемилюминесценции // Журн. аналит. химии. 2004. Т.59. № 1. С.84-86). Для количественной оценки суммарной АОА сравнивали восстановительную способность экстракта лекарственного сырья и активность сильнодействующего антиоксиданта - аскорбиновой кислоты в количестве 25-110 мкг. По сравнению с перечисленными способами в прототипе в качестве окислителя применяют пероксид водорода, взаимодействующий с широким кругом антиоксидантов, и измеренная величина суммарной АОА объекта определяется и выражается относительно аскорбиновой кислоты, являющейся общепринятым антиоксидантом, что позволяет получать достоверные результаты при сохранении остальных недостатков. К недостаткам также следует отнести и сложность применяемого в способе оборудования.
Технической задачей заявленного изобретения является разработка менее трудоемкого и достоверного способа определения суммарной антиоксидантной активности растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.
Для решения технической задачи предлагается взаимодействие аналита с реагентом 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролин, и аскорбиновой кислоты (АК) с таким же реагентом, который добавляют в соотношении 1:100, инкубируют не менее 90 мин, фотометрируют при 510±20 нм с последующим установлением зависимости величины аналитического сигнала от количества вещества и расчетом величины суммарной АОА. В частности, расчет можно осуществить по формуле (I), выведенной из уравнения количественного соответствия между исследуемым объектом и аскорбиновой кислотой:
где а, в - коэффициенты в уравнении регрессии для зависимости аналитического сигнала от количества АК;
а", в" - коэффициенты в уравнении регрессии для зависимости аналитического сигнала от количества исследуемого объекта;
х вос. - масса исследуемого восстановителя (образца), мг.
Использование предлагаемого реагента в указанных условиях позволило расширить линейный диапазон и снизить нижнюю границу определяемых количеств аскорбиновой кислоты. Предлагаемая совокупность существенных признаков позволяет определять суммарную АОА широкого круга растительного сырья и пищевых продуктов на его основе.
Уравнения количественного соответствия связывает зависимость аналитического сигнала от количества аскорбиновой кислоты и зависимость аналитического сигнала от количества исследуемого объекта при условии равной антиоксидантной активности.
После обработки результатов фотометрических измерений величины аналитического сигнала методом наименьших квадратов (К.Дерффель Статистика в аналитической химии. - М.: «Мир», 1994. С.164-169; А.К.Чарыков Математическая обработка результатов химического анализа - Л.: Химия, 1984. С.137-144) указанные зависимости были описаны линейной регрессионной функцией: y=ax+b, где а - коэффициент регрессии, b - свободный член. Коэффициент а в уравнении регрессии равен тангенсу угла наклона прямой к оси х; коэффициент b - расстоянию по оси у от начала координат (0,0) до первой точки (x 1 , y 1).
Коэффициенты а и b рассчитываются по формулам:
Уравнение регрессии для зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты в данный момент времени имеет вид:
у АК =а·х АК (мг)+b,
уравнение регрессии для зависимости АС от количества исследуемого объекта (восстановителя):
у ВОСТ =а"·х ВОСТ (мг)+b",
где у АК, у ВОСТ - оптическая плотность фотометрируемого раствора;
х АК (мг), х ВОСТ (мг) - концентрация аскорбиновой кислоты (восстановителя) в растворе;
тогда, приравнивая значения функций, получаем формулу (I) для расчета антиоксидантной активности исследуемого объекта в единицах количества (мг) аскорбиновой кислоты.
На чертеже отражена зависимость аналитического сигнала от количества восстановителя.
Измерение оптической плотности анализируемых растворов проводили на фотоэлектроколориметре КФК-2МП.
Известно (Ф.Умланд, А.Ясин, Д.Тирик, Г.Вюнш Комплексные соединения в аналитической химии - М.: Мир, 1975. - 531 с.), что о-фенантролин образует с железом(II) растворимый в воде хелат красно-оранжевого цвета, который характеризуется максимумом поглощения при λ=512 нм. Поэтому в предлагаемом способе фотометрирование проводят при λ=510±20 нм.
Оптимизацию состава реагента и его количества, вводимого в реакцию, проводили на основании результатов многофакторного планирования эксперимента методом «Латинского квадрата», которое заключалось в изменении в каждом опыте всех изучаемых факторов, причем каждый уровень каждого фактора только один раз встречается с различными уровнями других факторов. Это позволяет выделить и оценить эффект, вызываемый каждым изучаемым фактором в отдельности.
В качестве факторов выступали: количества Fe(III), о-фенантролина и объем реагента, вводимого в реакцию. Совокупность факторов должна обеспечивать широкий диапазон линейности аналитического сигнала (АС) при достаточной чувствительности, с одной стороны, и устойчивости реагента во времени, с другой. Это позволило для каждого фактора выделить следующие уровни:
количество Fe(III): 0,003 М (A 1); 0,006 М (А 2); 0,009 М (А 3);
количество о-фенантролина: 0,01 M (B 1); 0,02 М (В 2); 0,03 М (В 3);
объем реагента: 0,5 мл (C 1); 1,0 мл (С 2); 2,0 мл (С 3) (таблица 1).
Для выбора оптимальной комбинации уровней факторов получали градуировочные зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты в диапазоне от 10 до 150 мкг (что необходимо для подтверждения линейности функции), рассчитывали уравнение регрессии полученной зависимости, а затем величину АС при заданном количестве (120 мкг) аскорбиновой кислоты. Таким образом, для каждого состава реагента (факторы А, В) был подобран объем (фактор С), при котором значение АС максимально. Это позволило сократить число рассматриваемых комбинаций до девяти (таблица 2).
Сравнивая, суммарный АС для каждого уровня выделили суммы, имеющие максимальное значение: ΣA 2 (0,991); ΣB 1 (1,066); ΣC 2 (1,361). Это позволило заключить, что оптимальным является реагент состава: 0,006 М Fe(III) - 0,01 М о-фенантролина при его объеме, вводимом в реакцию, 1,0 мл на 100 мл раствора.
При оптимальной концентрации реагента изучили изменение зависимости АС от концентрации аскорбиновой кислоты и некоторых восстановителей, распространенных в природных объектах (танин, рутин, кверцетин), при различном времени инкубирования реакционной смеси (30, 60, 90, 120 мин). Было установлено, что для всех изучаемых восстановителей зависимость АС от их содержания линейна в диапазоне 10-150 мкг (см. чертеж) и величина АС зависит от времени инкубирования (таблица 3).
Из чертежа видно, что изменение АС под действием рутина незначительно, танина приближается, а кверцетина превосходит аналогичную зависимость для аскорбиновой кислоты. При рассмотрении изменения АС от времени инкубирования для всех изучаемых восстановителей (таблица 3) установлено, что стабилизация аналитического сигнала во времени наблюдается от 90 минут.
| Таблица 3 Изменение АС восстановителей во времени |
|||||
| Исследуемое вещество | m вещества, мг/см 3 | Аналитический сигнал | |||
| Время инкубирования реакционной смеси, мин | |||||
| 30 | 60 | 90 | 120 | ||
| Аскорбиновая кислота | 10 | 0,038 | 0,042 | 0,044 | 0,044 |
| 100 | 0,340 | 0,352 | 0,360 | 0,363 | |
| Танин | 10 | 0,029 | 0,037 | 0,042 | 0,043 |
| 100 | 0,280 | 0,295 | 0,303 | 0,308 | |
| Рутин | 10 | 0,013 | 0,016 | 0,019 | 0,019 |
| 100 | 0,150 | 0,166 | 0,172 | 0,175 | |
| Кверцетин | 10 | 0,031 | 0,044 | 0,051 | 0,053 |
| 100 | 0,420 | 0,431 | 0,438 | 0,442 |
Для доказательства суммирующего характера определяемой величины АОА было изучено влияние реагента Fe (III) - о-фенантролин на модельные растворы, в состав которых входили восстановители: танин, рутин, кверцетин и аскорбиновая кислота в различных соотношениях. В таблице 4 представлены результаты анализа модельных смесей.
| Таблица 4 Результаты анализа модельных смесей (Р=0,95; n=3) |
|||||||||
| Количество компонентов в смеси | Суммарная АОА, рассчитано, мкгАК | Суммарная АОА, найдено, мкгАК | |||||||
| введено | в пересчете на АК | ||||||||
| АК | Танин | Рутин | Кверцетин | АК | Танин | Рутин | Кверцетин | ||
| - | 20 | 20 | 20 | - | 16,77 | 9,56 | 32,73 | 59,06 | 57,08 |
| - | 10 | 10 | 10 | - | 8,35 | 4,77 | 16,41 | 29,53 | 26,95 |
| - | 50 | 10 | 10 | - | 42,02 | 4,77 | 16,41 | 63,20 | 55,04 |
| - | 10 | 50 | 10 | - | 8,35 | 23,93 | 16,41 | 48,69 | 50,06 |
| - | 10 | 10 | 50 | - | 8,35 | 4,77 | 81,70 | 94,82 | 91,61 |
| - | 30 | 10 | 10 | - | 25,19 | 4,77 | 16,41 | 46,37 | 39,24 |
| - | 10 | 30 | 30 | - | 8,35 | 14,35 | 49,06 | 71,76 | 73,47 |
| 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 16,77 | 9,56 | 32,73 | 79,06 | 96,29 |
| 50 | 10 | 10 | 10 | 50 | 8,35 | 4,77 | 16,41 | 87,95 | 93,07 |
| 10 | 50 | 10 | 10 | 10 | 42,02 | 4,77 | 16,41 | 73,20 | 78,15 |
| 10 | 10 | 50 | 10 | 10 | 8,35 | 23,93 | 16,41 | 58,69 | 78,74 |
| 10 | 10 | 10 | 50 | 10 | 8,35 | 4,77 | 81,70 | 104,82 | 121,45 |
| 30 | 30 | 10 | 10 | 30 | 25,19 | 4,77 | 16,41 | 76,37 | 84,59 |
| 10 | 10 | 30 | 30 | 10 | 8,35 | 14,35 | 49,06 | 81,76 | 103,31 |
Расчет теоретической величины суммарной АОА проводили по уравнениям количественного соответствия, характеризующим антиоксидантную способность исследуемого восстановителя по отношению к аскорбиновой кислоте, при условиях равной антиоксидантной активности: .
Величину экспериментальной (найденной) АОА рассчитывали по усредненному уравнению регрессии для зависимости АС от количества аскорбиновой кислоты. Из результатов, представленных в таблице 4, видно, что экспериментально полученные величины АОА удовлетворительно согласуются с теоретически рассчитанными.
Таким образом, определяемая величина АОА является суммарным показателем, а определение ее величины с использованием уравнений количественного соответствия является правильным.
Предлагаемый способ апробирован на реальных образцах. Для определения суммарной АОА реального образца или его экстракта получали градуировочные зависимости АС от количества аналита и аскорбиновой кислоты при времени инкубирования реакционной смеси не менее 90 минут. Расчет суммарной АОА проводили по формуле (I) и выражали в мг аскорбиновой кислоты на грамм исследуемого объекта (мгАК/г).
Для подтверждения правильности предлагаемого способа эти образцы испытывали по известным методикам, оценивая содержание аскорбиновой кислоты (ГОСТ 24556-89 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С) и преобладающих восстановителей: в чае - танина (ГОСТ 19885-74 Чай. Методы определения содержания танина и кофеина), в плодах шиповника - сумму органических кислот (ГОСТ 1994-93 Плоды шиповника. Технические условия) (таблица 5).
1 Милентьев В.Н. 2 Санников Д.П. 3 Казьмин В.М. 21 ФГБОУ ВПО «Орловский государственный институт экономики и торговли»
2 ФГБУ «Центр химизации и сельскохозяйственной радиологии «Орловский»
3 ФГБОУ ВПО «Государственный университет – учебно-научно-производственный комплекс»
Исследована возможность использования хемилюминесценции для оценки антиоксидантной активности пищевых веществ. Предлагаемый способ основан на хемилюминесценции люминола в щелочной среде, интенсивность которой зависит от количества пероксидов в хемилюминесцентной пробе. Хемилюминесценцию регистрировали с помощью разработанной установки, содержащей насос-дозатор, светонепроницаемую камеру, стеклянный вакуумный фотоумножитель, компьютерную систему. Для усиления хемилюминесценции к люминолу добавляли раствор железосинеродистого калия. Изменения интенсивности хемилюминесценции фиксировали в момент введения анализируемой пробы в раствор люминола. В качестве анализируемой пробы использовали экстракт одуванчика, полученный путем сухой низкотемпературной перегонки. В его состав входят фенольные соединения, известные своей высокой антиоксидантной активностью. Установлено, что метод хемилюминесценции может быть использован для определения антиоксидантных свойств различных пищевых соединений.
хемилюминесценция
антиоксидантная активность
пероксиды
пищевые вещества
1. Васильев Р.Ф. Химическое свечение // Химия и химики, 21.01.10. – URL: http://chemistry-chemists.com. (дата обращения: 22.08.13).
2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. – 1998. – № 7. – С. 43–51.
3. Кондрашова Е.А. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноферментного анализа и его применение // Клиническая лабораторная диагностика. – 1999. – № 9. – С. 32.
4. Любимов, Г.Ю. Хемилюминесцентный анализ // Иммунология. – 1991. – № 1. – С. 40–49.
5. Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л., Чеботарь И.В. Реактивная хемилюминесценция в системе фагоцитоза // Микробиология. – 1987. – № 1. – С. 109–115.
6. Шерстнев М.П. Кальцийзависимый и кальцийнезависимый пути генерации хемилюминесценции клеток // Вопросы хемилюминесценции. – 1991. – № 2. – С. 1–4.
На сегодняшний день хемилюминесценция представляет большую область науки, находящуюся на стыке между химией, физикой и биологией. При хемилюминесценции происходит прямое преобразование химической энергии в энергию электромагнитных колебаний, т.е. в свет. Используя хемилюминесценцию, можно узнать о том, как протекает реакция, каков ее механизм, что необходимо для эффективного и рационального проведения технологических процессов. Если технологический процесс получения какого-либо химического продукта сопровождается хемилюминесценцией, то ее интенсивность может служить мерой скорости процесса: чем быстрее идет реакция, тем ярче свечение. В ходе реакции хемилюминесценции получаются богатые энергией продукты, которые затем отдают энергию, излучая свет, т. е. химическая энергия превращается в энергию электромагнитного излучения .
Цель исследования - изучить возможность использования хемилюминесценции для оценки антиоксидантной активности пищевых веществ.
Результаты исследования и их обсуждение
Проблема оценки антиоксидантной активности пищевых веществ является весьма актуальной. Использование термина «антиоксидантная активность» для того, чтобы показать полезность того или иного продукта, зачастую делается без всякой химической и биохимической аргументации. Как правило, под антиоксидантной активностью любого вещества подразумевается эффективность снижения величины перекисного числа. Само же понятие перекисного числа также не совсем раскрывает свою химическую суть, поскольку не вполне соответствует кинетике и термодинамике стадий метаболизма того или иного пищевого продукта. К тому же эта величина используется для характеристики липидов в форме жиров . Однако процессы окисления и формирования перекисей в организме происходят не только при употреблении жиров, но и других продуктов. Другими словами, содержание перекиси в том или ином продукте можно сказать «взвешивается» на своеобразных весах, где «эталонным весом» является единица концентрации в кислой среде иодид иона, окисленного перекисями, вследствие чего образуется молекулярный иод:
I- - е → I; (1)
I + I → I20. (2)
При титровании молекулярного иода раствором, содержащим тиосульфат натрия, устанавливается его концентрация и, следовательно, определяется количество окислителей иодид ионов, т.е. перекисных соединений, что собственно и называется перекисным числом . Определение перекисного числа с помощью такого рода «взвешивания» основано на реакции, приведенной на рис. 1.
Рис. 1. Определение перекисного числа с помощью тиосульфата натрия
Таким образом, концентрация пероксидов определяется из уравнения
С(I2) = ϒ(C[-O-O-]), (3)
где ϒ - коэффициент корреляции между концентрацией молекулярного иода и концентрацией пероксидов.
Предлагаемый нами способ определения пероксидов в продуктах основан на хемилюминесценции люминола (C[лм]) в щелочной среде, интенсивность (Iхл) которой зависит от концентрации пероксидов (C[-O-O-]), в хемилюминесцентной пробе :
IХЛ. = Ϧхл ω, (4)
где Ϧхл - квантовый выход хемилюминесценции; ω - скорость реакции с участием пероксидов:
kхлC[-O-O-] C[лм] = ω, (5)
где kхл - константа скорости реакции или при:
C[лм] kхл Ϧхл = К, (6)
IХЛ = К C[ -O-O- ]. (7).
Количество пероксидов (-O-O-) определяется светосуммой (S):
Величина S зависит от степени полноты расходования перекиси в хемилюминесцентной реакции.
Для определения константы К строится калибровочная кривая зависимости светосуммы S от концентрации перекиси, которую устанавливают титрованием:
S = f(С[-O-O-]). (9)
В качестве пероксидов используется перекись водорода Н2О2.
Затем сравниваются данные, полученные из уравнения (3) и (9). На основании сравнения ϒ и К делается вывод о согласовании механизмов реакций, лежащих в основе определения пероксидов указанными способами. Выявлено, что в этом интервале концентраций пероксидов ϒ и К действительно согласуются друг с другом и поэтому их можно использовать для определения перекисного числа .
Хемилюминесценцию наблюдали в щелочной среде, содержащей люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой к-ты, H2L). Регистрировали ее с помощью хемилюминесцентной установки, включающей стеклянный вакуумный фотоумножитель. Питание фотоумножителя осуществляется с помощью высоковольтного выпрямителя (7), сопряженного с блоком (9), усиливающим сигнал фотоумножителя, который регистрируется на дисплее монитора компьютера (5).
Рис. 2. Регистрация хемилюминесценции анализируемого продукта: 1 - насос-дозатор; 2 - светонепроницаемая камера; 3 - зеркало; 4 - кювета; 5 - компьютерная система; 6 - фотоумножитель; 7 - высоковольтный выпрямитель; 8 - устройство, позволяющее определять спектральную область хеминилюминесцентного излучения; 9 - блок, усиливающий сигнал фотоумножителя
Насос-дозатор (1) необходим для ввода анализируемой пробы в кювету (4), содержащую хемилюминисцирующий раствор люминола. Данный дозатор выполняет роль перемешивателя вводимой пробы с хемилюминесцирующим раствором. Для усиления скорости реакции и интенсивности хемилюминесценции к люминолу добавляли раствор железосинеродистого калия. Перемешивание производится пузырьками воздуха, полученными при прокачивании насосом воздуха через жидкость раствора. Зеркало (3), находящееся в светонепроницаемой камере (2), служит для лучшего светосбора хемилюминесцентного излучения, падающего на фотокатод фотоумножителя (6), вмонтированного в светонепроницаемую камеру. Дозатор позволяет вводить нужные компоненты жидкости в кювету, не открывая светонепроницаемой камеры (2) во время опытов. При этом указанные жидкости поступают в кювету (4) по стеклянным либо пластмассовым трубкам. Компьютерная система позволяет регистрировать зависимость интенсивности свечения I от времени t, то есть кинетику хеминилюмисценции:
Компьютерная система отражает константы нарастания и спада в функции I = f(t), которые сопрягаются с константами скоростей реакций, обуславливающих хемилюминесценцию, то есть с их кинетиками . В хемилюминесцентную камеру включается устройство (8), позволяющее определять спектральную область хемилюминесцентного излучения, то есть зависимость:
I = f1(λ). (11)
Этот блок представляет собой кассету в виде диска, в которую вмонтированы граничные светофильтры. Смена светофильтров осуществляется поворотом кассеты диска относительно горизонтальной оси, соединяющей центры плоскости светофильтров и плоскости фотокатода фотоумножителя.
Процесс измерения осуществляется следующим образом:
1. Устанавливается реакция фотоумножителя на изменения напряжения его питания и на изменение интенсивности эталонного источника света, который падает на его катод.
2. Производится заполнение кюветы раствором люминола в щелочной среде.
3. Осуществляется заполнение дозатора анализируемой пробой.
4. Регистрируется зависимость интенсивности хемилюминесценции от времени t. Наблюдения за хемилюминесценцией осуществляется до момента времени t1, при котором изменение I1 от времени t минимально: I1 = f1(t).
5. Подается с помощью дозатора порция анализируемого раствора.
6. Наблюдается хемилюминесценция анализируемой пробы, кинетика которой I = f(t).
На рис. 3 представлен график зависимости функций (I1 = f1(t)), сопряженный с графиком (I = f(t)), после введения анализируемого раствора.
Как видно из рис. 3, интенсивность хемилюминесценции люминола меняется: за резким подъемом следует резкий спад свечения после добавления анализируемой пробы.
Поскольку усиление хемилюминесценции при окислении люминола связано с образованием пероксидов, то снижение интенсивности хемилюминесценции после введения анализируемой пробы свидетельствует об уменьшении их количества . Следовательно, можно говорить о наличии антиоксидантной активности у соединений, входящих в состав анализируемой пробы.
Необходимо отметить, что в качестве анализируемой пробы использовался полученный путем сухой низкотемпературной перегонки экстракт одуванчика, в состав которого входят фенольные соединения, известные своей высокой антиоксидантной активностью.
Рис. 3. График зависимости функций (I1 = f1(t)), сопряженный с графиком (I = f(t)), после введения анализируемого раствора
Кроме того, в ходе эксперимента установлено, что при помощи хемилюминесценции можно определять количество пероксидов в сверхразбавленных системах, что важно для оценки начала окисления продуктов, например, в процессе их хранения .
Таким образом, проведенные исследования показали, что способ определения пероксидов в продуктах, основанный на хемилюминесценции люминола в щелочной среде, позволяет оценить антиоксидантную активность пищевых веществ и может быть использован для установления антиоксидантных свойств различных пищевых соединений.
Рецензенты:
Литвинова Е.В., д.т.н., профессор кафедры технологии, организации и гигиены питания, ФГБОУ ВПО «ОрелГИЭТ», г. Орел;
Ковалева О.А., д.б.н., директор ИНИИЦ, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», г. Орел.
Работа поступила в редакцию 08.11.2013.
Библиографическая ссылка
Паничкин А.В., Большакова Л.С., Милентьев В.Н., Санников Д.П., Казьмин В.М. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ПИЩЕВЫХ ВЕЩЕСТВ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 10-11. – С. 2436-2439;URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32810 (дата обращения: 17.12.2019). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
