ახალი გენმოდიფიცირებული ცილები, რომლებიც დაფუძნებულია რეკომბინანტულ ანტი-TNF ანტისხეულებზე, ეფიმოვი გრიგორი ალექსანდროვიჩი. გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდები რეკომბინანტული ცილების მიღებისას გენეტიკური ინჟინერიის ცილები
გენეტიკური ინჟინერია არის ფუნქციურად აქტიური გენეტიკური სტრუქტურების (რეკომბინანტული დნმ) ინ ვიტრო კონსტრუქცია ან სხვა სიტყვებით რომ ვთქვათ, ხელოვნური გენეტიკური პროგრამების შექმნა (Baev A.A.). ე.ს. ფირუზიანის გენეტიკური ინჟინერია არის ექსპერიმენტული მეთოდების სისტემა, რომელიც შესაძლებელს ხდის ლაბორატორიაში ხელოვნური გენეტიკური სტრუქტურების აგებას (ინ ვიტრო) ეგრეთ წოდებული რეკომბინანტული ან ჰიბრიდული დნმ-ის მოლეკულების სახით.
გენეტიკური ინჟინერია არის გენეტიკური მასალის ახალი კომბინაციების წარმოება უჯრედის გარეთ ნუკლეინის მჟავას მოლეკულებით მანიპულირებით და შექმნილი გენის კონსტრუქციების ცოცხალ ორგანიზმში გადაცემით, რაც იწვევს მათ ჩართვას და აქტივობას ამ ორგანიზმში და მის შთამომავლობაში. საუბარია მიმართულ, წინასწარ განსაზღვრული პროგრამის მიხედვით, მოლეკულური გენეტიკური სისტემების კონსტრუქციაზე სხეულის გარეთ მათი შემდგომი შეყვანით ცოცხალ ორგანიზმში. ამ შემთხვევაში რეკომბინანტული დნმ ხდება რეციპიენტი ორგანიზმის გენეტიკური აპარატის განუყოფელი ნაწილი და მას ახალ უნიკალურ გენეტიკურ, ბიოქიმიურ, შემდეგ კი ფიზიოლოგიურ თვისებებს ანიჭებს.
გამოყენებითი გენეტიკური ინჟინერიის მიზანია ისეთი რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულების დაპროექტება, რომლებიც გენეტიკურ აპარატში შეყვანისას სხეულს ადამიანისათვის სასარგებლო თვისებებს მისცემს. მაგალითად, "ბიოლოგიური რეაქტორების" მოპოვება - მიკროორგანიზმები, მცენარეები და ცხოველები, რომლებიც აწარმოებენ ფარმაკოლოგიურად მნიშვნელოვან ნივთიერებებს ადამიანისთვის, მცენარეთა ჯიშებისა და ცხოველთა ჯიშების შექმნა, გარკვეული თვისებებით, რომლებიც ღირებულია ადამიანისთვის. გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდები შესაძლებელს ხდის გენეტიკური სერტიფიცირების ჩატარებას, გენეტიკური დაავადებების დიაგნოსტირებას, დნმ-ის ვაქცინების შექმნას და სხვადასხვა დაავადების გენური თერაპიის ჩატარებას.
რეკომბინანტული დნმ ტექნოლოგია იყენებს შემდეგ მეთოდებს:
დნმ-ის სპეციფიური დაშლა შეზღუდვის ნუკლეაზებით, ცალკეული გენების იზოლაციისა და მანიპულირების დაჩქარება;
გასუფთავებული დნმ-ის ფრაგმენტის ყველა ნუკლეოტიდის სწრაფი თანმიმდევრობა, რაც საშუალებას გაძლევთ განსაზღვროთ გენის საზღვრები და მის მიერ დაშიფრული ამინომჟავების თანმიმდევრობა;
რეკომბინანტული დნმ-ის აგება;
ნუკლეინის მჟავას ჰიბრიდიზაცია, რომელიც საშუალებას იძლევა უფრო დიდი სიზუსტით და მგრძნობელობით გამოავლინოს სპეციფიკური რნმ ან დნმ-ის თანმიმდევრობა, მათი კომპლემენტური ნუკლეინის მჟავების თანმიმდევრობების შეკავშირების უნარის საფუძველზე;
დნმ-ის კლონირება: ინ ვიტრო გაძლიერება პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციით ან დნმ-ის ფრაგმენტის შეყვანა ბაქტერიულ უჯრედში, რომელიც ასეთი ტრანსფორმაციის შემდეგ ამრავლებს ამ ფრაგმენტს მილიონობით ეგზემპლარად;
რეკომბინანტული დნმ-ის შეყვანა უჯრედებში ან ორგანიზმებში.
რეკომბინანტული მოლეკულების აგება ხორციელდება მთელი რიგი ფერმენტების, უპირველეს ყოვლისა, შემზღუდველი ფერმენტების დახმარებით. ამჟამად გამოიყენება 400-ზე მეტი სხვადასხვა შეზღუდვა. ეს ფერმენტები ასინთეზირებენ მრავალფეროვან მიკროორგანიზმებს.
შეზღუდვის ფერმენტები ცნობენ და ჭრიან სპეციფიკურ ნუკლეოტიდურ თანმიმდევრობებს ორჯაჭვიანი დნმ-ის მოლეკულაში. თუმცა, მხოლოდ შეზღუდვის ფერმენტები არ არის საკმარისი მოლეკულური კლონირებისთვის, რადგან წყალბადის ბმები ოთხ ფუძეს შორის, რომლებიც ქმნიან წებოვან ბოლოებს, არ არის საკმარისად ძლიერი იმისათვის, რომ შეინახოს ორი გაერთიანებული დნმ ფრაგმენტი.
რეკომბინანტული დნმ-ის მოლეკულის ერთი ნაწილი ატარებს სასურველ გენს, რომელიც უნდა იყოს კლონირებული, მეორე შეიცავს ინფორმაციას, რომელიც აუცილებელია რეკომბინანტული დნმ-ის რეპლიკაციისთვის უჯრედში.
ბუნებრივი გადარჩევა არის ევოლუციის მამოძრავებელი ძალა
ბუნებრივი გადარჩევა არის პროცესი, რომელიც ხელს უწყობს საუკეთესოს გადარჩენას და ნაკლებად მორგებულთა განადგურებას. უფრო ადაპტირებულ პირებს აქვთ შთამომავლობის დატოვების შესაძლებლობა. საქმის შერჩევის მასალა
პექტინის ნივთიერებების დუღილის გამომწვევი აგენტების იდენტიფიცირება
გამოცდილების დაყენება. 6-7 სმ სიმაღლის სელის ჩალის ძაფს ორ ადგილას ახვევენ ძაფით და ათავსებენ სტანდარტულზე უკეთეს სინჯარაში, 2/3 ონკანის წყლით სავსე. სინჯარას ამაგრებენ პინცეტით და ადუღებენ სანთურზე...
ბიოსფეროდან ნოოსფეროზე გადასვლა
კაცობრიობის გონებისა და შრომის გარდაქმნა გეოლოგიურ ძალად პლანეტარული მასშტაბით მოხდა ბიოსფეროს შიგნით, რომლის განუყოფელი ნაწილია ისინი. და. ვერნადსკი თავის კვლევებში უცვლელად ხაზს უსვამდა რა უზარმაზარ გავლენას ...
პროტეინის ინჟინერია არის ბიოტექნოლოგიის ფილიალი, რომელიც ეხება სასარგებლო ან ღირებული ცილების განვითარებას. ეს არის შედარებით ახალი დისციპლინა, რომელიც ფოკუსირებულია ცილის დაკეცვის შესწავლაზე და ცილის მოდიფიკაციისა და დიზაინის პრინციპებზე.
ცილის ინჟინერიის ორი ძირითადი სტრატეგია არსებობს: მიმართული ცილის მოდიფიკაცია და მიმართული ევოლუცია. ეს მეთოდები არ არის ურთიერთგამომრიცხავი; მკვლევარები ხშირად იყენებენ ორივეს. მომავალში, ცილების სტრუქტურისა და ფუნქციის უფრო დეტალური ცოდნა, ისევე როგორც მაღალი ტექნოლოგიების მიღწევები, შესაძლოა მნიშვნელოვნად გააფართოოს ცილების ინჟინერიის შესაძლებლობები. შედეგად, არაბუნებრივი ამინომჟავებიც კი შეიძლება შევიდეს ახალი მეთოდის წყალობით, რომელიც გენეტიკურ კოდში ახალი ამინომჟავების შეყვანის საშუალებას იძლევა.
ცილის ინჟინერია წარმოიშვა ცილების ფიზიკისა და ქიმიისა და გენეტიკური ინჟინერიის კვეთაზე. ის წყვეტს მოდიფიცირებული ან ჰიბრიდული ცილის მოლეკულების შექმნის პრობლემას სასურველი მახასიათებლებით. ასეთი ამოცანის განხორციელების ბუნებრივი გზაა მოდიფიცირებული ცილის კოდირების გენის სტრუქტურის პროგნოზირება, მისი სინთეზის განხორციელება, კლონირება და ექსპრესია მიმღებ უჯრედებში.
ცილის პირველი კონტროლირებადი მოდიფიკაცია განხორციელდა 1960-იანი წლების შუა ხანებში კოშლანდისა და ბენდერის მიერ. პროტეაზას აქტიურ ცენტრში, სუბტილისინში, ჰიდროქსილის ჯგუფის სულფჰიდრილის ჯგუფით ჩანაცვლებისთვის გამოიყენეს ქიმიური მოდიფიკაციის მეთოდი. თუმცა, როგორც გაირკვა, ასეთი თიოლსუბტილისინი არ ინარჩუნებს პროტეაზას აქტივობას.
პროტეინი ქიმიური თვალსაზრისით არის იმავე ტიპის მოლეკულა, რომელიც წარმოადგენს პოლიამინომჟავის ჯაჭვს ან პოლიმერს. იგი შედგება 20 ტიპის ამინომჟავების თანმიმდევრობისგან. ცილების სტრუქტურის შესწავლის შემდეგ, ადამიანებმა საკუთარ თავს დაუსვეს კითხვა: შესაძლებელია თუ არა სრულიად ახალი ამინომჟავების თანმიმდევრობების შემუშავება ისე, რომ მათ შეასრულონ ის ფუნქციები, რომლებიც ადამიანს სჭირდება ბევრად უკეთ, ვიდრე ჩვეულებრივი ცილები? ამ იდეისთვის გაჩნდა სახელი Protein Engineering.
ასეთ ინჟინერიაზე ფიქრი მათ ჯერ კიდევ XX საუკუნის 50-იან წლებში დაიწყეს. ეს მოხდა პირველი ცილის ამინომჟავების თანმიმდევრობის დეკოდირების შემდეგ. მსოფლიოს მრავალ ლაბორატორიაში გაკეთდა მცდელობები ბუნების დუბლირებისთვის და ქიმიურად სინთეზირებული პოლიამინომჟავების თანმიმდევრობები, რომლებიც მოცემულია აბსოლუტურად თვითნებურად.
ყველაზე მეტად ამაში წარმატებას მიაღწია ქიმიკოსმა ბ.მერიფილდმა. ამ ამერიკელმა მოახერხა პოლიამინომჟავების ჯაჭვების სინთეზის უკიდურესად ეფექტური მეთოდის შემუშავება. ამის გამო მერიფილდს 1984 წელს მიენიჭა ნობელის პრემია ქიმიაში.
სურათი 1. ცილის ინჟინერიის ფუნქციონირების სქემა
ამერიკელმა დაიწყო მოკლე პეპტიდების, მათ შორის ჰორმონების, სინთეზირება. პარალელურად მან ააშენა ავტომატი – „ქიმიური რობოტი“ – რომლის ამოცანა იყო ხელოვნური ცილების გამომუშავება. რობოტმა სამეცნიერო წრეებში სენსაცია გამოიწვია. თუმცა, მალევე გაირკვა, რომ მისი პროდუქცია ვერ უწევს კონკურენციას იმას, რასაც ბუნება აწარმოებს.
რობოტს ზუსტად არ შეეძლო ამინომჟავების თანმიმდევრობის რეპროდუცირება, ანუ არასწორი იყო. მან ერთი ჯაჭვი ერთი მიმდევრობით ასინთეზა, მეორე კი ოდნავ შეცვლილი. უჯრედში ერთი ცილის ყველა მოლეკულა იდეალურად ჰგავს ერთმანეთს, ანუ მათი თანმიმდევრობა ზუსტად იგივეა.
ასევე იყო სხვა პრობლემა. იმ მოლეკულებმაც კი, რომლებიც რობოტმა სწორად მოახდინა სინთეზი, არ მიიღო ის სივრცითი ფორმა, რომელიც აუცილებელია ფერმენტის ფუნქციონირებისთვის. ამრიგად, ბუნების ჩანაცვლების მცდელობამ ორგანული ქიმიის ჩვეულებრივი მეთოდებით გამოიწვია ძალიან მოკრძალებული წარმატება.
მეცნიერებს ბუნებისგან უნდა ესწავლათ, ეძებდნენ ცილების საჭირო მოდიფიკაციას. აქ საქმე იმაშია, რომ მუტაციები ბუნებაში მუდმივად ხდება, რაც იწვევს ცილების ამინომჟავების თანმიმდევრობის ცვლილებას. თუ შევარჩევთ საჭირო თვისებების მქონე მუტანტებს, რომლებიც ამა თუ იმ სუბსტრატს უფრო ეფექტურად ამუშავებენ, მაშინ შესაძლებელია ასეთი მუტანტიდან გამოვყოთ შეცვლილი ფერმენტი, რის გამოც უჯრედი ახალ თვისებებს იძენს. მაგრამ ამ პროცესს ძალიან დიდი დრო სჭირდება.
ყველაფერი შეიცვალა, როდესაც გენეტიკური ინჟინერია გამოჩნდა. მისი წყალობით, მათ დაიწყეს ხელოვნური გენების შექმნა ნუკლეოტიდების ნებისმიერი თანმიმდევრობით. ეს გენები შეიყვანეს მომზადებულ ვექტორულ მოლეკულებში და ეს დნმ-ები შეიყვანეს ბაქტერიებში ან საფუარში. იქ ხელოვნური გენიდან ამოიღეს რნმ-ის ასლი. შედეგად წარმოიქმნა სასურველი ცილა. მის სინთეზში შეცდომები გამოირიცხა. მთავარი იყო დნმ-ის სწორი თანმიმდევრობის არჩევა და შემდეგ თავად უჯრედის ფერმენტულმა სისტემამ უნაკლოდ შეასრულა თავისი საქმე. ამრიგად, შეგვიძლია დავასკვნათ, რომ გენეტიკურმა ინჟინერიამ გზა გაუხსნა ცილების ინჟინერიას მისი ყველაზე რადიკალური ფორმით.
ცილის ინჟინერიის სტრატეგიები
ცილის მიზნობრივი მოდიფიკაცია. ცილის მიზნობრივი მოდიფიკაციისას მეცნიერი იყენებს ცილის სტრუქტურისა და ფუნქციის დეტალურ ცოდნას სასურველი ცვლილებების შესატანად. ზოგადად, ამ მეთოდს აქვს უპირატესობა, რომ არის იაფი და ტექნიკურად გაურთულებელი, რადგან ადგილზე მიმართული მუტაგენეზის ტექნიკა კარგად არის განვითარებული. თუმცა, მისი მთავარი მინუსი არის ის, რომ ცილის დეტალური სტრუქტურის შესახებ ინფორმაცია ხშირად აკლია და მაშინაც კი, როდესაც სტრუქტურა ცნობილია, შეიძლება ძალიან რთული იყოს სხვადასხვა მუტაციების გავლენის პროგნოზირება.
პროტეინის მოდიფიკაციის პროგრამული ალგორითმები ცდილობენ ამოიცნონ ახალი ამინომჟავების თანმიმდევრობები, რომლებიც საჭიროებენ მცირე ენერგიას წინასწარ განსაზღვრული სამიზნე სტრუქტურის შესაქმნელად. მიუხედავად იმისა, რომ მოსაძებნი თანმიმდევრობა დიდია, ცილის მოდიფიკაციის ყველაზე რთული მოთხოვნა არის ოპტიმალური თანმიმდევრობის იდენტიფიცირებისა და განსაზღვრის სწრაფი, მაგრამ ზუსტი გზა მსგავსი სუოპტიმალური თანმიმდევრობისგან განსხვავებით.
მიმართული ევოლუცია. მიმართული ევოლუციის დროს, შემთხვევითი მუტაგენეზი გამოიყენება ცილაზე და შერჩევა ხდება ვარიანტების შესარჩევად, რომლებსაც აქვთ გარკვეული თვისებები. გამოიყენება მუტაციისა და შერჩევის შემდგომი რაუნდები. ეს მეთოდი მიბაძავს ბუნებრივ ევოლუციას და ზოგადად იძლევა შესანიშნავ შედეგებს მიმართული მოდიფიკაციისთვის.
დამატებითი ტექნიკა, რომელიც ცნობილია როგორც დნმ-ის გადარევა, აერთიანებს და გამოაქვს წარმატებული ვარიანტების ნაწილები უკეთესი შედეგისთვის. ეს პროცესი მიბაძავს რეკომბინაციებს, რომლებიც ბუნებრივად ხდება სქესობრივი გამრავლების დროს. მიმართული ევოლუციის უპირატესობა ის არის, რომ ის არ საჭიროებს წინასწარ ცოდნას ცილის სტრუქტურის შესახებ და არც არის საჭირო, რათა წინასწარ განსაზღვროს, თუ რა გავლენას მოახდენს მოცემული მუტაცია. მართლაც, მიმართული ევოლუციის ექსპერიმენტების შედეგები გასაკვირია, ვინაიდან სასურველი ცვლილებები ხშირად გამოწვეულია მუტაციებით, რომლებსაც ასეთი ეფექტი არ უნდა ჰქონდეს. მინუსი არის ის, რომ ეს მეთოდი მოითხოვს მაღალ გამტარუნარიანობას, რაც შეუძლებელია ყველა ცილისთვის. რეკომბინანტული დნმ-ის დიდი რაოდენობით უნდა მოხდეს მუტაცია და პროდუქტების სკრინინგი სასურველი ხარისხისთვის. პარამეტრების დიდი რაოდენობა ხშირად მოითხოვს რობოტიკის შეძენას პროცესის ავტომატიზაციისთვის. გარდა ამისა, ყოველთვის ადვილი არ არის ყველა საინტერესო თვისების სკრინინგი.
ზემოთ განხილულ პეპტიდურ ბიბლიოთეკებში, ეს უკანასკნელი კოვალენტურად არის დაკავშირებული მატარებელ ცილასთან. ამ ფორმით ისინი გენეტიკური ინჟინერიით მიღებული ჰიბრიდული ცილების ერთ-ერთი წარმომადგენელია.
სხვა შემთხვევაში, შერწყმული ცილები გამოიყენება ბაქტერიულ უჯრედებში მოკლე პეპტიდების გამოხატვის მაღალი დონის მისაღებად, ამ პეპტიდების შერწყმის პროტეინებში სტაბილიზაციის გამო. შერწყმული პროტეინები ხშირად გამოიყენება ძნელად გამოვლენილი რეკომბინანტული ცილების იდენტიფიცირებისთვის და გასაწმენდად. მაგალითად, -გალაქტოზიდაზას, როგორც რეპორტიორი ცილის მიმაგრებით შესასწავლი ცილის C-ბოლოზე, შესაძლებელია რეკომბინანტული ცილის გასუფთავება -გალაქტოზიდაზას აქტივობით, მისი ანტიგენური დეტერმინანტების განსაზღვრა იმუნოქიმიური მეთოდებით. ღია წაკითხვის ჩარჩოების (ORF) შემცველი დნმ-ის ფრაგმენტების რეპორტიორის ცილის გენებთან დაკავშირებით, შესაძლებელია ასეთი შერწყმული ცილების გაწმენდა რეპორტიორის ცილის აქტივობისთვის და მათი გამოყენება ლაბორატორიული ცხოველების იმუნიზაციისთვის. შედეგად მიღებული ანტისხეულები შემდეგ გამოიყენება მშობლიური ცილის გასაწმენდად, რომელიც მოიცავს ORF-ით დაშიფრულ რეკომბინანტულ პოლიპეპტიდს და ამით იდენტიფიცირებს კლონირებული გენის ფრაგმენტს.
ჰიბრიდული ცილების დახმარებით წყდება უცნობი გენის კლონირების საპირისპირო პრობლემაც, რომლის ცილოვან პროდუქტზე არის ანტისხეულები. ამ შემთხვევაში, ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების კლონური ბიბლიოთეკა, რომლებიც წარმოადგენენ უცნობი გენების ORF-ებს, აგებულია ვექტორებში, რომლებიც საშუალებას აძლევს კლონირებულ ORF-ს დაუკავშირდეს იმავე კითხვის ჩარჩოში, როგორც მომხსენებელი გენი. ამ რეკომბინანტული გენების ექსპრესიის შედეგად მიღებული ჰიბრიდული ცილები იდენტიფიცირებულია ანტისხეულების გამოყენებით ფერმენტული იმუნოანალიზის მეთოდებით. ჰიბრიდული გენები, რომლებიც აერთიანებენ გამოყოფილ ცილებს და რეპორტიორ ცილებს, შესაძლებელს ხდის სეკრეციის მექანიზმების ახლებურად შესწავლას, აგრეთვე ქსოვილებში გამოყოფილი ცილების ლოკალიზაციას და მოძრაობას.
ჰიბრიდული ტოქსინები
ი. პასტანისა და მისი თანამშრომლების ნამუშევრების სერია მიზანმიმართული ჰიბრიდული ტოქსინების დიზაინზე შესანიშნავად ასახავს ცილების ინჟინერიის შესაძლებლობებს ცილების სხვადასხვა ფუნქციური დომენების გაერთიანების თვალსაზრისით სპეციფიკური ბიოლოგიური ეფექტების მისაღწევად.
ბრინჯი. II.22. ჰიბრიდულ ტოქსინებზე დაფუძნებული მიზნობრივი მედიკამენტები
ა- წამლის სტრუქტურის განზოგადებული სქემა მიმართული მოქმედებით; ბ– ფსევდომონადური ტოქსინის სტრუქტურა (რიცხვები მიუთითებს ამინომჟავის ნარჩენების პოზიციაზე); in- ჰიბრიდული ტოქსინის სტრუქტურა; გ- ჰიბრიდული ტოქსინი, რომელიც დაფუძნებულია მონოკლონურ ანტისხეულებზე
მკაცრად სპეციფიკური სელექციური მოქმედების იდეალურ პრეპარატს უნდა ჰქონდეს მინიმუმ შემდეგი სტრუქტურული და ფუნქციური მახასიათებლები (ნახ. II.22, ა). ასეთი პრეპარატი უნდა შეიცავდეს აქტიურ პრინციპს ფიზიოლოგიური ეფექტის მისაღწევად და ლიგანდს, რომელიც ამოიცნობს რეცეპტორს სამიზნე უჯრედების ზედაპირზე. გარდა ამისა, ის უნდა შეიცავდეს სტრუქტურულ ელემენტებს, რომლებიც აღიარებულია სხეულის სატრანსპორტო სისტემის მიერ წამლის მიწოდებისთვის სამიზნე უჯრედებამდე, ისევე როგორც სპაზერის ადგილს, რომელიც აუცილებელია პრეპარატის აქტიური პრინციპის გამოსაყოფად მის მისამართზე მიტანის შემდეგ. სწორედ ეს იდეალური სქემაა რეალიზებული Pseudomonas aeruginosa-ს ბუნებრივ ეგზოტოქსინში. P. aeruginosa ეგზოტოქსინი A არის ცილა, რომელიც შედგება ერთი პოლიპეპტიდური ჯაჭვისგან 613 ამინომჟავების სიგრძისგან, რომელიც ორგანიზებულია სამ ფუნქციურ დომენად (იხ. სურ. II.22, ბ). N-ტერმინალური დომენი Ia (ამინომჟავის ნარჩენები 1-252) საჭიროა სამიზნე უჯრედების ზედაპირთან ურთიერთქმედებისთვის (იდეალური მიზნობრივი პრეპარატის პროტოტიპის ლიგანდი). დომენის Ib (ამინომჟავის ნარჩენები 365-404) ფუნქციები ამჟამად უცნობია. დომენი II (ამინომჟავის ნარჩენები 253-364) უზრუნველყოფს ტოქსინის ეფექტურ გადატანას უჯრედის ციტოზოლში (ნარკოტიკების სატრანსპორტო სისტემა), ხოლო III დომენი (ამინომჟავის ნარჩენები 405-613) ახორციელებს ადპ-რიბოზილირებას ტრანსლაციის გახანგრძლივების ფაქტორის EF2, რომელიც იწვევს ტრანსლაციის და უჯრედების სიკვდილის მიზნების ჩახშობას. ამგვარად, ეგზოტოქსინ A-ს ციტოტოქსიური ეფექტის მისაღწევად, აუცილებელია უჯრედის ზედაპირზე რეცეპტორების ამოცნობა დომენის Ia-ს გამოყენებით, შეაღწიონ უჯრედში რეცეპტორების შუამავლობით ენდოციტოზის გამოყენებით და გადაადგილდნენ შიდა მემბრანის მეშვეობით ციტოზოლში, სადაც EF2 ფაქტორია. ლოკალიზებულია. მიზანმიმართული ტოქსინების შექმნის მთავარი იდეა იყო Ia დომენის შეცვლა სხვა პეპტიდური ლიგანდით, რომელიც ურთიერთქმედებს სხვა რეცეპტორების ჯგუფთან უჯრედის ზედაპირზე და ამით შეცვლიდა ტოქსინის მოქმედების სპეციფიკას თავად უჯრედებთან მიმართებაში (იხ. II 22, in).
აღმოჩნდა, რომ გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდებით Ia დომენის მოცილება მკვეთრად (ასობით და ათასობითჯერ) ამცირებს ასეთი შეკვეცილი ცილის ტოქსიკურობას როგორც სხვადასხვა ხაზის უჯრედებთან, ასევე in vivo-სთან მიმართებაში. ადამიანის ინტერლეიკინ 2-ის მოლეკულის შეკვეცილი პოლიპეპტიდის C-ტერმინალურ ნაწილზე მიმაგრება განხორციელდა ექსპრესიულ ვექტორში შესაბამისი გენების სტრუქტურული ნაწილების გაერთიანებით. გაწმენდილი ჰიბრიდული ტოქსინი აღმოჩნდა უკიდურესად ტოქსიკური უჯრედებისთვის, რომლებიც ატარებენ ინტერლეიკინ 2 რეცეპტორებს მათ ზედაპირზე და არ მოქმედებდა უჯრედებზე, რომლებსაც არ აკლდათ ეს რეცეპტორები და რომლებიც მოკვდნენ ბუნებრივი ტოქსინის მოქმედებით. ინტერნალიზაცია(უჯრედებში ტრანსლოკაცია) ჰიბრიდული ტოქსინის შუამავლობით განხორციელდა ინტერლეიკინ 2-ის რეცეპტორის p55 და p70 ქვედანაყოფები. ამრიგად, ჰიბრიდული ტოქსინის მოქმედების შედეგად უჯრედების პოპულაციაზე, რომელთაგან ზოგიერთი გამოხატავს ინტერლეიკინ 2-ის რეცეპტორებს მათზე. ზედაპირზე, ამ უჯრედების შერჩევითი სიკვდილი ხდება.
სხეულში მოსვენებული და მეხსიერების T უჯრედების უმეტესობა არ გამოხატავს მაღალი აფინურობის ინტერლეიკინ 2 რეცეპტორებს თავის ზედაპირზე, ხოლო ალოანტიგენებით სტიმულირებული T უჯრედები შეიცავს ასეთ რეცეპტორებს. ამიტომ, ჰიბრიდული ტოქსინის ინტრაპერიტონეალური შეყვანა ვირთხებში ექსპერიმენტული ართრიტით, დაავადება, რომელიც გამოწვეულია T-უჯრედების პათოლოგიური გააქტიურებით, ამცირებს დაავადების სიმპტომებს. ჰიბრიდულმა ტოქსინმა მნიშვნელოვნად შეამცირა ტრანსპლანტაციის უარყოფა თაგვებშიც.
ამ პიონერულ სამუშაოებს მოჰყვა კვლევების მთელი სერია, რომელიც მიზნად ისახავდა მსგავსი სისტემების შექმნას სხვადასხვა ციტოტოქსიური პოლიპეპტიდების მიზნობრივი მიწოდებისთვის. ფსევდომონას ტოქსინის მიზანმიმართული მიწოდების სისტემის შემდგომი გაუმჯობესების პროცესში, ინტერლეიკინ 2-ის, როგორც ლიგანდის გამოყენებით, მათ მიატოვეს ტოქსინის სამიზნე დომენის სრული მოცილება და შემოიფარგლეს მისი ინაქტივაციით ოთხი უბნის სპეციფიკური მუტაციების შეყვანით. ტოქსინის გენი. ამ ჰიბრიდული ტოქსინის მოლეკულები აღმოჩნდა 10-100-ჯერ უფრო ეფექტური ციტოტოქსიური აგენტები ადამიანისა და მაიმუნის უჯრედების წინააღმდეგ, რომლებიც გამოხატავენ რეცეპტორებს ინტერლეიკინ 2-ისთვის მათ ზედაპირზე და ასევე ჰქონდათ მნიშვნელოვნად უფრო გრძელი ნახევარგამოყოფის პერიოდი თაგვების სისხლში in vivo-სთან შედარებით. ადრე მიღებული კონსტრუქცია.
Pseudomonas ტოქსინის საფუძველზე შეიქმნა ჰიბრიდული ტოქსინები, რომლებიც შეიცავდნენ ინტერლეიკინ 4-ის, ინტერლეიკინ 6-ის პოლიპეპტიდურ ჯაჭვებს, ტრანსფორმირებელი ზრდის ფაქტორის ტიპის და ინსულინის მსგავსი ზრდის ფაქტორი I ლიგანდებს. ნაჩვენები იყო მაღალი სპეციფიკური ციტოტოქსიურობა სიმსივნური უჯრედების მიმართ (მათ შორის ადამიანის მიელომის უჯრედები). ყველა ამ ჰიბრიდული ცილისთვის. ) შესაბამისი რეცეპტორებით. CD4 პოლიპეპტიდური ჯაჭვის ნაწილის გამოყენებამ ლიგანდად ჰიბრიდულ ტოქსინში, T უჯრედების ზედაპირის გლიკოპროტეინში, რომელიც არის აივ ვირუსის რეცეპტორი და ურთიერთქმედებს მის გლიკოპროტეინ gp120-თან, შესაძლებელი გახადა T უჯრედების შერჩევითი ინფიცირება. ინფიცირებული აივ ვირუსით და გამოხატავს ვირუსულ gp120 პროტეინს მათ ზედაპირზე.
აივ ვირუსით გამოწვეული ინფექციის ჩახშობის იგივე პრინციპი ხსნადი CD4 რეცეპტორებით გამოიყენებოდა ჰიბრიდული ცილების მშენებლობაში, რომლებიც აერთიანებენ CD4 პოლიპეპტიდური ჯაჭვების ნაწილებს ადამიანის იმუნოგლობულინების მძიმე ან მსუბუქი ჯაჭვების მუდმივ ნაწილებთან. ამავდროულად, გენების გაერთიანების პროცესში ამოღებულია ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობები, რომლებიც აკოდირებენ CD4-ის ტრანსმემბრანულ და ციტოპლაზმურ დომენებს, ასევე იმუნოგლობულინების პოლიპეპტიდური ჯაჭვების ცვლადი ნაწილი. შედეგად მიღებული ჰიბრიდული მოლეკულები, ე.წ იმუნოადჰეზინებიიმუნოგლობულინის მოლეკულის მუდმივი ნაწილის გამო, მათ შეიძინეს სხეულში გაზრდილი სტაბილურობა და, გარდა ამისა, შეინარჩუნეს სპეციფიკური თვისებები იმუნოგლობულინების მუდმივი ნაწილების შუამავლობით: Fc რეცეპტორის და პროტეინის A შეკავშირება, კომპლემენტის და გადაცემის უნარი. პლაცენტური ბარიერის გავლით. ყველა ამ თვისების ერთობლიობამ შესაძლებელი გახადა იმუნოადჰეზინების ეფექტურად შეწყვეტა T-უჯრედების ინფექცია აივ-I ვირუსით, ბლოკავს როგორც თავად ვირუსს, ასევე მის მიერ ინფიცირებულ უჯრედებს, გამოხატავს gp120 ვირუსულ ანტიგენს მათ ზედაპირზე.
Pseudomonas ეგზოტოქსინ A-ზე დაფუძნებული გენეტიკურად შემუშავებული კონსტრუქციების შემდგომი გაუმჯობესება მოხდა მას შემდეგ, რაც მონოკლონური ანტისხეულების ცვლადი დომენები ადამიანის ინტერლეიკინ 2-ის რეცეპტორის p55 კომპონენტის მიმართ გამოიყენებოდა, როგორც ჰიბრიდული ტოქსინის სამიზნე ნაწილი. ამ რეკომბინანტულ ცილაში, 15-მერიანი პეპტიდური ამინომჟავის დამაკავშირებელი იყო გამოყენებული ამ იმუნოგლობულინის მძიმე ჯაჭვის ცვლადი დომენის დასაკავშირებლად მისი მსუბუქი ჯაჭვის ცვლად დომენთან და მსუბუქი ჯაჭვის C-ბოლო N-ბოლოსთან დასაკავშირებლად. შეკვეცილი Pseudomonas ტოქსინის (იხ. სურ. II.22, გ). ასეთი ჰიბრიდული ტოქსინის მოლეკულები ასევე აღმოჩნდა უაღრესად სპეციფიური ციტოტოქსიური აგენტები ადამიანის ლეიკემიური უჯრედების წინააღმდეგ, რომლებიც გამოხატავენ ინტერლეიკინ 2 რეცეპტორებს მათ ზედაპირზე.
შემუშავებულმა მიდგომამ აჩვენა სპეციფიკური ანტისხეულების, როგორც ჰიბრიდული ტოქსინების სამიზნე ნაწილების გამოყენების შესაძლებლობა. ეს მკვლევარებს აძლევს ტოქსინების მიზანმიმართული მიწოდების უნივერსალურ მეთოდს, რაც მომავალში შესაძლებელს გახდის ციტოტოქსიური ეფექტის განხორციელებას უჯრედების ნებისმიერ ჯგუფზე, რომელიც გამოხატავს სპეციფიკურ ანტიგენებს მათ ზედაპირზე, ე.ი. მნიშვნელოვნად აფართოებს ქიმიოთერაპიული ეფექტების სამიზნეების რაოდენობას რეკომბინანტული ცილების გამოყენებით.
Pseudomonas ეგზოტოქსინ A-ს გარდა, დიფტერიის ტოქსინი, სიმსივნის ნეკროზის ფაქტორი და რიცინი A ჯაჭვი წარმატებით გამოიყენება როგორც აქტიური პრინციპი ჰიბრიდულ ტოქსინებში. ვინაიდან A-პროტეინი შერჩევით ურთიერთქმედებს მრავალი ძუძუმწოვრის G- კლასის იმუნოგლობულინების მუდმივ (Fc) ნაწილებთან, ასეთი ჰიბრიდული ტოქსინი, დაწყვილებული იმუნოგლობულინთან, რომელიც მომზადებულია უჯრედის ზედაპირზე ანტიგენის საწინააღმდეგოდ, შერჩევით აკავშირებს და კლავს ამ უჯრედებს. ასეთი იმუნოტოქსინები არის კიდევ ერთი პოტენციური სიმსივნის საწინააღმდეგო აგენტი და შეიძლება გამოყენებულ იქნას უჯრედების წინააღმდეგ, რომლებიც გამოხატავენ სპეციფიკურ ანტიგენებს მათ ზედაპირზე.
ბრინჯი. II.23. შერწყმული ცილის გამოყენება გენის ექსპრესიის დასარეგულირებლად
გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდები ხსნის უსასრულო შესაძლებლობებს ახალი ცილების აგებისთვის, პოლიპეპტიდური ჯაჭვების სხვადასხვა ფუნქციური დომენების სხვადასხვა კომბინაციებში გაერთიანებით. მიზანმიმართული ჰიბრიდული ტოქსინების წარმოება ასახავს ასეთი მიდგომის შესაძლებლობებს ცილების ინჟინერიაში. როგორც ამ ჯგუფის მეთოდების შესაძლებლობების საბოლოო ილუსტრაცია, მოდით განვიხილოთ ჰიბრიდული ცილა, როგორც გენის აქტივობის ახალი რეგულატორი. გენეტიკური ინჟინერიით ასეთი ცილის აგებისას, გლუკოკორტიკოიდული ჰორმონის რეცეპტორში დნმ-ის დამაკავშირებელი დომენი შეიცვალა E. coli LexA რეპრესორის შესაბამისი დომენით (ნახ. II.23).
გენის ოპერატორის თანმიმდევრობის დანერგვა lexAგლობინის გენის (ან სხვა გენების) პრომოტორულ რეგიონში შევიდა პრომოტორის გააქტიურება ჰიბრიდული ცილის მოქმედებით დექსამეტაზონის თანდასწრებით, სინთეზური ჰორმონი, რომელიც ურთიერთქმედებს გლუკოკორტიკოიდულ რეცეპტორებთან. ამრიგად, ახალ გენეტიკურ გარემოში, გენის ოპერატორის ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა lexA E. coli ფუნქციონირებდა, როგორც ტრანსკრიპციის გამაძლიერებელი, შერწყმის აქტივატორი ცილის თანდასწრებით, რომელიც აღიარებს ამ თანმიმდევრობას. სამუშაოს შედეგები აჩვენებს ახალი ცილების - გენის აქტივობის რეგულატორების შექმნის შესაძლებლობას ცნობილი ფუნქციური დომენების გაერთიანებით.
ცილების ინჟინერიის განვითარება დიდწილად შეზღუდულია ცილებში სტრუქტურული და ფუნქციური ურთიერთობების შესახებ ცოდნის ნაკლებობით, რაც განპირობებულია კვლევის ობიექტის სირთულით. მრავალი ნაშრომი, რომელიც მიმართულია ამგვარი ურთიერთობების შესწავლაზე, როგორც წესი, ემპირიული ხასიათისაა და მთავრდება ფერმენტების აქტიური უბნების ფუნქციონირებისთვის აუცილებელი ამინომჟავების ლოკალიზაციით. ამრიგად, ცილის ინჟინერიის მთავარი ამოცანა - სასურველი თვისებების მქონე ცილის მიღება ამინომჟავების ნარჩენების ცნობილი თანმიმდევრობიდან - ამჟამად ჯერ კიდევ შორს არის გადაწყვეტილებისგან. მიუხედავად ამისა, ახლაც კი ზოგჯერ შესაძლებელია მიზანმიმართულად შეიცვალოს არსებული ფერმენტების ზოგიერთი თვისება მათი პოლიპეპტიდური ჯაჭვების მცირე რაოდენობის ამინომჟავების ნარჩენების ჩანაცვლებით ადგილზე მიმართული მუტაგენეზის გამოყენებით.
480 რუბლი. | 150 UAH | $7,5 ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> ნაშრომი - 480 რუბლი, მიწოდება 10 წუთი 24 საათი დღეში, კვირაში შვიდი დღე და არდადეგები
ეფიმოვი გრიგორი ალექსანდროვიჩი. ახალი გენმოდიფიცირებული ცილები TNF-ის წინააღმდეგ რეკომბინანტულ ანტისხეულებზე დაფუძნებული: დისერტაცია... ბიოლოგიურ მეცნიერებათა კანდიდატი: 03.01.03 / ეფიმოვი გრიგორი ალექსანდროვიჩი; [დაცვის ადგილი: V.A.-ს სახელობის მოლეკულური ბიოლოგიის ინსტიტუტი - 122 გვ.
შესავალი
ლიტერატურის მიმოხილვა 9
1. tnf-ის გახსნის ისტორია 9
2. სუპეროჯახი tnf 10
3. სისტემის სტრუქტურა tnfnfr 12
4. tnf ფუნქციები 15
5. TNF-ის როლი რევმატოიდული ართრიტის და სხვა აუტოიმუნური დაავადებების პათოგენეზში 16
6. თერაპიული ბლოკირება tnf 18
7. გვერდითი მოვლენები და ანტი-ინფ თერაპიის შეზღუდვები 23
8. ახალი მიდგომები და პერსპექტივები tnf ბლოკირებისთვის 25
კვლევის მასალები და მეთოდები 29
1. ახალი აქლემის ერთდომენიანი ანტიადამიანის tnf ანტისხეულის მომზადება და დახასიათება 29
ერთი დომენის ანტისხეულის Vhh41 გამოხატვა და გაწმენდა 29
Vhh41 ანტისხეულის ადამიანის TNF-თან შეკავშირების შეფასება ELISA 30-ით
Vhh41-ისა და ადამიანის TNF-ის ურთიერთქმედების კვლევა ზედაპირული პლაზმის რეზონანსით 31
კვლევები Vhh41-ის უნარზე დაბლოკოს ადამიანის TNF 31
2. TNF ფლუორესცენტური სენსორების ჰიბრიდული ცილების მშენებლობა, წარმოება და დახასიათება 32
TNF სენსორების კოდირების გენების აგება. 32
ფლუორესცენტური TNF სენსორების გამოხატვა და გაწმენდა. 33
Vhh41-K-ის ურთიერთქმედების ანალიზი რეკომბინანტულ TNF-თან. 34
ფლუორესცენტური სენსორის Vhh41-KTNFin ვიტრო და in vivo ბიოლოგიური თვისებების გამოკვლევა. Z5
ფლუორესცენტური სენსორის უნარის შესწავლა TNF in vivo 36-ში
TNF გამოხატვის in vivo შესწავლა მიღებული ფლუორესცენტური სენსორის გამოყენებით...39
3. ერთჯაჭვიანი ANTINF ანტისხეულის წარმოება და დახასიათება 40
თაგვის მონოკლონური ანტისხეულის F10 40 კვლევა
ahT-4 41 ერთი ჯაჭვის ანტისხეულის აგება და ექსპრესია
ahT-4 ერთი ჯაჭვის ანტისხეულის ბიოლოგიური აქტივობის გაზომვა 42
4. ქიმერული ანტი-ინფ ანტისხეულის მომზადება და დახასიათება 43
5. A9 და MA9 ორსპეციფიკური ანტისხეულების აგება, მომზადება და დახასიათება 43
A9 და tA9 ანტისხეულების აგება, გამოხატვა და გაწმენდა 43 A9 და tA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედება ადამიანის რეკომბინანტულ TNF მეთოდთან
ზედაპირის პლაზმის რეზონანსი 44
ციტოტოქსიური ტესტი 45
ციტოფლორმეტრია 45
ბისპეციფიკური A9 ანტისხეულის უნარის შეფასება, შეინარჩუნოს ადამიანის TNF
მაკროფაგების ზედაპირი 45
6. მაკროფაგების TNF-ის სისტემური და სელექციური ბლოკირების ეფექტურობის შედარებითი შეფასება 46
JIIJC/D-გალაქტოზამინის 46-ის შეყვანით გამოწვეული მწვავე ჰეპატოტოქსიურობის მოდელი
შედეგები და დისკუსია 48
1. ახალი რეკომბინანტული ერთი დომენის ანტისხეულის მიღება და დახასიათება, რომელიც სპეციალურად უკავშირდება ადამიანის TNF-ს, მაგრამ არ ბლოკავს მის ბიოლოგიურ აქტივობას 50
გენეტიკური კონსტრუქციის შექმნა, რომელიც აკოდირებს რეკომბინანტულ ერთდომენ ანტისხეულს
რეკომბინანტული ერთი დომენის ანტისხეულის Vhh41 52 გამოხატვა და გაწმენდა
ერთდომენიანი Vhh41 ანტისხეულის ურთიერთქმედების ანალიზი ადამიანის TNF 53-თან
Vhh41 ანტისხეულის უნარის ანალიზი დაბლოკოს ადამიანის TNF-ის ბიოლოგიური აქტივობა.54
2. TNF მოლეკულური სენსორების მშენებლობა, წარმოება და დახასიათება tnf ექსპრესიის in vivo კვლევისთვის, რომელიც დაფუძნებულია ერთი დომენის რეკომბინანტულ ანტისხეულებზე და წითელ ფლუორესცენტურ ცილაზე 56
გენეტიკური კონსტრუქტების მიღება, რომლებიც აკოდირებენ TNF Vhh41-Ku ფლუორესცენტურ სენსორს
შერწყმის ცილების კონტროლი 56
TNF Vhh41-K ფლუორესცენტური სენსორის გამოხატვა და გაწმენდა. 57
ფლუორესცენტური სენსორის TNF Vhh41-K ურთიერთქმედების ანალიზი თაგვის რეკომბინანტულ TNF-თან
და ადამიანი 58
ფლუორესცენტური სენსორის TNF Vhh41-Kin ვიტრო და in vivo ბიოლოგიური თვისებების შესწავლა. 61
ფლუორესცენტური სენსორის უნარის შესწავლა TNF in vivo 66-ში
TNF გამოხატვის in vivo შესწავლა მიღებული ფლუორესცენტური სენსორის გამოყენებით... 69
3. TNF 72-ის ბიოლოგიური აქტივობის ბლოკირების რეკომბინანტული ერთჯაჭვის ანტისხეულის მომზადება და დახასიათება
თაგვის მონოკლონური ანტისხეულის F10 72 აქტივობის გაზომვა
ფილტვის ცვლადი ფრაგმენტებზე დაფუძნებული ერთჯაჭვიანი ანტისხეულის აგება და
თაგვის მონოკლონური ანტისხეულების მძიმე ჯაჭვები F 10 74
ahT-4 75 ერთჯაჭვიანი ანტისხეულის აქტივობის გაზომვა
4. ქიმერული ანტი-ადამიანის TNF ანტისხეულის შემუშავება და ანალიზი
ქიმერული ანტისხეულის 13239 და ინფლიქსიმაბის ურთიერთქმედების კინეტიკის შედარება
ადამიანის რეკომბინანტული TNF 77 ქიმერული ანტისხეულის 13239 განეიტრალებელი აქტივობის შედარება
ინფლიქსიმაბი ინ ვიტრო 79
ქიმერული ანტისხეულის 13239 აქტივობის ანალიზი in vivo 80
5. მონოციტ-მაკროფაგების სერიის უჯრედების მიერ წარმოებული სელექციური tnf ბლოკერის დიზაინი, წარმოება და დახასიათება 82
ორსპეციფიკური ანტისხეულების მოლეკულური კლონირება, ექსპრესია და გაწმენდა 82
A9 და mA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედება ადამიანის რეკომბინანტულ TNF 86-თან
ანტისხეულები A9 და rA9 ბლოკავს TNF-დამოკიდებულ ციტოტოქსიურობას in vitro 87
ანტისხეულების A9 და tA9 შეკავშირების ანალიზი მაკროფაგების ზედაპირზე ურთიერთქმედების გზით
ზედაპირის მოლეკულა F4/80 89
ენდოგენურად წარმოქმნილი ადამიანის TNF-ის შეკავება მაკროფაგების ზედაპირზე
ორსპეციფიკური ანტისხეული A9 93
6. მონოციტ-მაკროფაგების სერიის უჯრედების მიერ წარმოებული tnf-ის ფიზიოლოგიურად მნიშვნელოვანი შერჩევითი ბლოკირება in vivo 96
მონოციტურ-მაკროფაგების სერიის უჯრედების მიერ წარმოქმნილი TNF-ის მიზანმიმართული ბლოკირების ეფექტურობის შედარებითი შეფასება და TNF-ის სისტემური ბლოკირების მწვავე მოდელში
ჰეპატოტოქსიურობა 96
დასკვნა 99
წყაროები 100
TNF-ის როლი რევმატოიდული ართრიტის და სხვა აუტოიმუნური დაავადებების პათოგენეზში
ანტიციტოკინებით თერაპიის პირველი გამოცდილება განხორციელდა 1985 წელს, როდესაც თაგვებს გაუკეთეს პოლიკლონური ანტიNF კურდღლის შრატი, რომელიც ხელს უშლიდა LPS-ის შეყვანით გამოწვეული ლეტალური ჰეპატოტოქსიურობის განვითარებას. მსგავსი შედეგები მიღებულ იქნა მაიმუნებში: ბაბუნი, რომელსაც გაუკეთეს თაგვის მონოკლონური ანტისხეული ადამიანის TNF-ის წინააღმდეგ, გადარჩნენ E. coli-ს ლეტალური დოზის ინტრავენური ინექციის შემდეგ [104].
პირველი თერაპიული TNF ბლოკატორი შეიქმნა თაგვის მაღალი აფინურობის მონოკლონური ანტისხეულისგან A2, რომელიც მიღებული იყო ადამიანის TNFα-ით იმუნიზირებული თაგვებიდან. იმის გამო, რომ სხვა სახეობების ანტისხეულებს აქვთ მნიშვნელოვანი განსხვავებები ამინომჟავების თანმიმდევრობაში, ისინი შეუსაბამოა ადამიანებში ხანგრძლივი თერაპიული გამოყენებისთვის. ამიტომ, გენეტიკური ინჟინერიით, მძიმე და მსუბუქი ჯაჭვების თაგვის მუდმივი დომენები შეიცვალა ადამიანის დომენებით. ცვლადი რეგიონები, რომლებიც აკავშირებს ანტიგენს, უცვლელი დარჩა. ასეთ ანტისხეულებს ქიმერულს უწოდებენ. შემდგომში, ამ პირველმა თერაპიულმა ანტი-TNF ანტისხეულმა მიიღო საერთაშორისო არაკომერციული სახელი - ინფლიქსიმაბი.
ანტიNF თერაპიის ერთ-ერთი ყველაზე აშკარა გამოყენება იყო სეფსისის მკურნალობაში. თუმცა, კლინიკურმა კვლევებმა არ აჩვენა მნიშვნელოვანი შედეგები, რაც, როგორც ჩანს, განპირობებულია იმით, რომ სეფსისის კლინიკური სურათის განვითარების დროისთვის უკვე შეუქცევადი სასიგნალო კასკადები გადის.
ამ დროისთვის უკვე დაგროვილი იყო მრავალი მტკიცებულება, რომელიც მიუთითებს TNF-ის მონაწილეობაზე რევმატოიდული ართრიტის პათოგენეზში, ამიტომ ეს დაავადება აირჩიეს ანტიNF თერაპიის შემდეგ პოტენციურ სამიზნედ. რევმატოიდული ართრიტის დროს ინფლიქსიმაბის საპილოტე კვლევებმა აჩვენა იმედისმომცემი შედეგები და შემდგომმა რანდომიზებულმა, ორმაგად ბრმა კვლევებმა დაადასტურა ანტიNF თერაპიის ეფექტურობა აუტოიმუნური დაავადებების მკურნალობაში. თუმცა, განმეორებითი ინექციების შემდეგ, ზოგიერთ პაციენტს განუვითარდა თაგვის ამინომჟავების თანმიმდევრობისთვის სპეციფიკური ანტისხეულები ცვლად დომენებში, რამაც შეამცირა თერაპიის ეფექტურობა.
ორმაგად ბრმა, რანდომიზებულმა კვლევამ აჩვენა, რომ ინფლიქსიმაბს აქვს სინერგიული ეფექტი მეტოტრექსატის დაბალი დოზებით, ციტოტოქსიური პრეპარატი, რომელიც გამოიყენება მონოთერაპიისთვის RA. კომბინაციაში ეს ორი პრეპარატი უფრო ეფექტურია და ინფლიქსიმაბის იმუნოგენურობა მცირდება. II/III ფაზის შემდგომმა კლინიკურმა კვლევებმა გამოიწვია ინფლიქსიმაბის დამტკიცება RA-ს სამკურნალოდ.
ინფლიქსიმაბის მოქმედების მექანიზმი ძირითადად განპირობებულია ხსნადი TNF-ის შეკავშირებით სისტემურ მიმოქცევაში და ადგილობრივი გადაჭარბებული გამოხატვის ადგილებში (სინოვიალური ღრუ RA). მაგრამ, გარდა ამისა, ინფლიქსიმაბს შეუძლია დაუკავშირდეს TNF ტრანსმემბრანულ ფორმას და გამოიწვიოს უჯრედების ლიზისი, რომლებიც მას ატარებენ მათ ზედაპირზე ანტისხეულზე დამოკიდებული ციტოტოქსიურობის მექანიზმით.
AntiNF თერაპია არღვევს პათოლოგიური სასიგნალო კასკადს და იწვევს ანთებითი პასუხის შემცირებას, მაგრამ, გარდა ამისა, მას შეუძლია დააბალანსოს დაქვეითებული იმუნური სისტემა. TNF ინჰიბიტორების შეყვანის ფონზე იცვლება T-ეფექტორისა და T-მარეგულირებელი უჯრედების ბალანსი.
AntiNF თერაპია არ არის ეტიოტროპული თერაპია და თეორიულად უნდა იქნას გამოყენებული პაციენტის მთელი ცხოვრების განმავლობაში, თუმცა ზოგიერთ შემთხვევაში შესაძლებელია სტაბილური რემისიის მიღწევა, რომელიც გრძელდება ანტიNF თერაპიის შეწყვეტის შემდეგაც.
TNF-ის ბლოკატორებმა აჩვენეს თავიანთი ეფექტურობა სხვა აუტოიმუნური და ანთებითი დაავადებების მკურნალობაში: ნაჩვენებია, რომ TNF მნიშვნელოვან როლს ასრულებს კრონის დაავადების პათოგენეზში - ის ჭარბად არის გამოხატული ნაწლავის ანთებით ადგილებში. წინასწარი წარმატებები რეფრაქტორული კრონის დაავადების მკურნალობაში ინფლიქსიმაბით მოგვიანებით დადასტურდა რანდომიზებულ კლინიკურ კვლევებში, რის შედეგადაც დამტკიცებული იქნა ინფლიქსიმაბი ამ დაავადებისთვისაც.
მაანკილოზებელი სპონდილიტის (ბეხტერევის დაავადება) პათოგენეზი, კიდევ ერთი ქრონიკული სისტემური აუტოიმუნური დაავადება, რომელიც უპირატესად აზიანებს სახსრებს, ასევე განპირობებულია TNF-ის გადაჭარბებით. ინფლიქსიმაბის კლინიკური კვლევები წარმატებული იყო ამ დაავადებისთვისაც. გარდა ამისა, ანტიNF თერაპიამ აჩვენა მაღალი ეფექტურობა ფსორიაზის და ფსორიაზული ართრიტის მკურნალობაში.
დღეისათვის, ინფლიქსიმაბი და სხვა TNF ბლოკატორები დამტკიცებულია, როგორც თერაპიული აგენტები შემდეგი აუტოიმუნური დაავადებებისთვის: რევმატოიდული ართრიტი, არასრულწლოვანთა იდიოპათიური ართრიტი, მაანკილოზებელი სპონდილიტი, კრონის დაავადება, წყლულოვანი კოლიტი, ფსორიაზი, ფსორიაზული ართრიტი. გარდა ამისა, TNF ანტაგონისტებმა აჩვენეს დადებითი შედეგები სარკოიდოზის, ვეგენერის გრანულომატოზის, ბეჰჩეტის დაავადების და სხვა ქრონიკული დაავადებების მკურნალობაში.
ჩვენებები, რომ TNF თამაშობს როლს გაფანტული სკლეროზის პათოგენეზში, დადასტურებულია ცხოველებზე ლაბორატორიული ექსპერიმენტებით. TNF-ის დანერგვამ გააუარესა ექსპერიმენტული აუტოიმუნური ენცეფალომიელიტის სიმპტომები ვირთხებში და ანტიNF ანტისხეულების შეყვანამ ხელი შეუშალა ამ დაავადების განვითარებას.
თუმცა, კლინიკურმა კვლევებმა გაფანტული სკლეროზის დროს ინფლიქსიმაბით და სხვა TNF ბლოკატორით, ლენერცეპტით (ხსნადი TNFR1), არ გამოიღო მნიშვნელოვანი კლინიკური პასუხი. უფრო მეტიც, ზოგიერთ პაციენტში
მოდელი აუტოიმუნური დაავადება, რომლის პათოგენეზი გაფანტული სკლეროზის მსგავსია. დაფიქსირდა დაავადების კლინიკური სიმპტომების ზრდა და უჯრედულობის და იმუნოგლობულინების დონის მატება ცერებროსპინალურ სითხეში, გაიზარდა კერების რაოდენობა მაგნიტურ-რეზონანსულ ტომოგრაფიაში.
ინფლიქსიმაბის წარმატებამ ბიძგი მისცა ახალი მოლეკულების განვითარებას, რომლებსაც შეუძლიათ დაბლოკონ სიგნალის ტრანსდუქცია TNFR-ით. გარდა ამისა, თაგვის თანმიმდევრობა ინფლიქსიმაბის მძიმე და მსუბუქი ჯაჭვების ცვლად დომენებში იწვევდა მეორადი ანტისხეულების გამომუშავებას ზოგიერთ პაციენტში, რაც ბლოკავდა ინფლიქსიმაბის მოქმედებას და აქცევდა პაციენტებს თერაპიისადმი რეზისტენტულს. ამ შეზღუდვის დასაძლევად, არჩეული იქნა გზა ინჰიბიტორების შესაქმნელად სრული ადამიანის ამინომჟავების თანმიმდევრობით.
დღეისათვის, ინფლიქსიმაბის გარდა, ოთხი TNF ანტაგონისტი დამტკიცებულია კლინიკური გამოყენებისთვის (იხ. სურათი 2):
ეტანერცეპტი არის რეკომბინანტული TNF ინჰიბიტორი, რომელიც აგებულია ხსნადი TNFR2-ისგან. მისი განვითარება ეფუძნებოდა მონაცემებს, რომ მეორე TNF რეცეპტორის ხსნადი ფორმა არის ადამიანის სხეულში. მეტალოპროტეაზებით დესკვამირებული, TNFR2 არის დამატებითი რგოლი TNF აქტივობის რეგულირებაში. ეტანერცეპტი არის TNFR2 უჯრედგარე ნაწილის დიმერი, რომელიც გენეტიკურად არის შერწყმული IgG1 იმუნოგლობულინის Fc ფრაგმენტთან. ანტისხეულების მუდმივ რეგიონთან დაკავშირება მნიშვნელოვნად ზრდის პრეპარატის სისტემურ ნახევარგამოყოფის პერიოდს FcRn რეცეპტორის მეშვეობით ცილის გადამუშავებით. შერწყმული ცილის განეიტრალებელი აქტივობა გამოვლინდა როგორც in vitro, ასევე in vivo ექსპერიმენტებში და მოგვიანებით დადასტურდა კლინიკურ კვლევებში რევმატოიდული ართრიტის მქონე პაციენტებში.
თუმცა, ნაწლავის ანთებითი დაავადების მკურნალობისას ეტანერცეპტი, ინფლიქსიმაბისგან განსხვავებით, არ აჩვენა თერაპიული ეფექტურობა. ექსპერიმენტული TNF ბლოკატორი, ონერცეპტი, რომელიც დაფუძნებულია სხვა TNF რეცეპტორზე, TNFR1 (p55), მიუხედავად წამახალისებელი საპილოტე კლინიკური კვლევებისა რანდომიზებულ, პლაცებოზე კონტროლირებად, ორმაგად ბრმა კვლევაში, ასევე არ აჩვენა ეფექტურობა კრონის დაავადების მკურნალობაში. ინ ვიტრო კვლევამ, რომელიც გამოიკვლია კრონის დაავადების მქონე პაციენტების ლამინა პროპრიის T-ლიმფოციტები, აჩვენა, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ინფლიქსიმაბიც და ეტანერცეპტიც ბლოკავს TNF-ს, მხოლოდ ინფლიქსიმაბი უკავშირდება დაზიანების T უჯრედებს და იწვევს მათში აპოპტოზს. ამით შეიძლება აიხსნას განსხვავება ანტისხეულებზე დაფუძნებული და რეკომბინანტული რეცეპტორებზე დაფუძნებული ბლოკატორების ეფექტურობაში ნაწლავის ანთებითი დაავადების დროს.
Vhh41-ისა და ადამიანის TNF-ის ურთიერთქმედების კვლევა ზედაპირული პლაზმის რეზონანსით
გენეტიკური კონსტრუქცია, რომელიც აკოდირებს A9 ორსპეციფიკურ ანტისხეულს, აწყობილი იყო 4-პრაიმერის GAP რეაქციით, რომელიც ზემოთ აღწერილი იყო ahT-4 ერთი ჯაჭვის ანტისხეულის გენისთვის. შედეგად მიღებული თანმიმდევრობა შედგებოდა: ერთი დომენის ანტიNF ანტისხეულის გენი, შემდეგ თანმიმდევრობა, რომელიც აკოდირებს (Gly4Ser)3 სახეობის მაკავშირებელს და ერთი ჯაჭვის ანტი-P4/80 ანტისხეულის გენი (ს. გორდონისა და მ. სტეისის თავაზიანობით). შეზღუდვის ამოცნობის ადგილები Ncol და Xhol ჩართული იყო წინა და საპირისპირო პრაიმერების თანმიმდევრობაში, შესაბამისად. PCR პროდუქტის შეზღუდვისა და ექსპრესიის ვექტორში pET-28b (Novagen) კლონირების შემდეგ, პოლიჰექსიდინის ტეგის კოდირების თანმიმდევრობა იყო მე-3 ბოლოში იმავე კითხვის ჩარჩოში. საკონტროლო ანტისხეულის wA9 მისაღებად, მუტანტის ანტი-G4/80 scFv გენი, რომელიც შეიცავს გლიცინ-სერინის ჩანართებს CDR თანმიმდევრობების ნაცვლად, სინთეზირებული იყო de-novo (Geneart, გერმანია) და კლონირებულ იქნა ადგილობრივი ანტი-F4/80 გენის ნაცვლად (იხ. ნახ. 31B).
გამოხატვის ვექტორები, რომლებიც ატარებენ A9 და shA9 კოდირებულ ჩანართებს, გამოყენებული იქნა Rosetta2(DE3)pLysS შტამის (Novagen) E. coli უჯრედების ტრანსფორმირებისთვის. საუკეთესო მწარმოებელი კლონები შეირჩა კოლონიის იმუნობლოტირებით ნიკელ-კონიუგირებული პეროქსიდაზას გამოყენებით (Pierce, 15165). ბაქტერიული კულტურები გაიზარდა LB გარემოში, რომელიც შეიცავდა 50 ცგ/მლ კარბენიცილინს (Sigma-C1389) და 50 ცგ/მლ ქლორამფენიკოლს (Sigma-C1863) ლოგარითმულ ფაზაში, შემდეგ კი ექსპრესია ინდუცირებული იყო 0.2 მმ IPTG-ით. 4 საათის შემდეგ, კულტურები ექვემდებარებოდნენ ცენტრიფუგას 3200 გ-ზე 30 წუთის განმავლობაში. მარცვლები გაყინული იყო და შემდეგ ხელახლა შეჩერდა ლიზის ბუფერში (50 მმ TrisHCl, 300 MMNaCl, 5% გლიცეროლი, 0,5% Triton X-100 სარეცხი საშუალება, 10000 ე/მლ ლიზოზიმი, 10 მმ P-მერკაპტოეთანოლთან ერთად დისინტეგრაციული) და შემდეგ დისინტეგრაციული ულტრატონით. ლიზატები ცენტრიფუგირებულ იქნა 17,000 გ-ზე 40 წუთის განმავლობაში, აგროვებდნენ ზენატანებს და გაფილტრავდნენ 0,22 სმ ფორების დიამეტრის მქონე ფილტრში. ორსპეციფიკური ანტისხეულები A9 და tA9 გაწმენდილი იქნა გაწმენდილი ზენატანებისგან ქრომატოგრაფიულ სვეტზე, რომელიც შეიცავდა აგაროზას კონიუგირებულ Ni-nitriloacetic მჟავასთან (Invitrogen R90115). აფინური ქრომატოგრაფია ჩატარდა მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით. მიღებული ელუატი კონცენტრირებული იყო, დიალიზებული იყო ფოსფატის ბუფერული მარილის წინააღმდეგ, რასაც მოჰყვა ფილტრაცია 0.22 მკმ ფილტრის მეშვეობით. ცილის კონცენტრაცია ხსნარში გაზომილი იყო რეაქციის გამოყენებით 2,2-ბიცინქონინის მჟავასთან (PIERCE 23225 ნაკრები) მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით. მიღებული პრეპარატის ერთგვაროვნება შემოწმდა ელექტროფორეზით 15% პოლიაკრილამიდის გელში ნატრიუმის დოდეცილ სულფატის თანდასწრებით, რასაც მოჰყვა Coomassie შეღებვა.
A9 და mA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედება ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-თან ზედაპირული პლაზმონის რეზონანსით.
A9 და mA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედების აფინურობისა და კინეტიკის შედარება ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-თან ჩატარდა ProteOn XPR36 ინსტრუმენტზე (Bio-Rad). ყველა ურთიერთქმედების გაზომვისას გამოიყენეს ფოსფატ-ბუფერული ფიზიოლოგიური ხსნარი (pH = 7,4), რომელსაც ემატებოდა სარეცხი საშუალება Tween 20 კონცენტრაციით 0,005%, ჩიპის ზედაპირის ტემპერატურა იყო 25 C. რეკომბინანტული ადამიანის TNF გამოისახა E. coli ადრე აღწერილი მეთოდის მიხედვით. ანტისხეულები A9 და tA9 50 ნმ კონცენტრაციით იყო იმობილიზაცია ამინო ჯგუფის მეშვეობით ბიოჩიპის ზედაპირზე მოდიფიცირებული ალგინატის პოლიმერული ზედაპირით (Bio-Rad 176-5011). შემდეგ ანალიტი (ადამიანის TNF) ხუთ ორმაგად კლებადი კონცენტრაციით (50 -3 ნმ) იქნა გამოყენებული ხუთ პარალელურ არხზე. ბუფერი, რომელიც არ შეიცავს ანტისხეულებს, შეიყვანეს მეექვსე არხში ნორმალიზებისთვის. მიღებული სენსოგრამების ანალიზი განხორციელდა ProteOn Manager (Bio-Rad) პროგრამაში Langmuir მოდელის გამოყენებით.
პერიტონეალური მაკროფაგების ექსპერიმენტებში, პერიტონეალური ღრუს უჯრედები იზოლირებული იყო ველური ტიპის (C57BL/6) თაგვებიდან და დაუყოვნებლივ შეღებილი იქნა ფტოროქრომით კოიუგირებული ანტისხეულების გამოყენებით. ძვლის ტვინის მაკროფაგების მისაღებად, ძვლის ტვინი იზოლირებული იყო, რის შემდეგაც უჯრედები 10 დღის განმავლობაში კულტივირებული იყო კონდიცირებულ გარემოში (მიღებული L929 ხაზით), შემდეგ უჯრედები ამოიღეს პლასტმასიდან ყინულივით ცივი ფოსფატის ბუფერით.
შეღებვამდე, Fc-გამა რეცეპტორი დაიბლოკა, შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იყო A9 ან tA9 ანტისხეულებით ან ბუფერით, რის შემდეგაც უჯრედები გარეცხილი და შეღებილი იქნა სამი გზით: 1) პოლიკლონური კურდღლის ანტისხეულები hTNF-VnH-ზე, შემდეგ მეორადი ანტისხეულები კურდღლის IgG-ს მიმართ, კონიუგირებული ფტოროქრომით. 2) თაგვის მონოკლონური ანტისხეულები ჰექსაჰისტიდინის თანმიმდევრობის მიმართ (Novagen - 70796), შემდეგ მეორადი ანტისხეულებით თაგვის IgG-ს მიმართ, კონიუგირებული ფტოროქრომით. 3) უჯრედებს დაემატა ადამიანის რეკომბინანტული TNF, რასაც მოჰყვა მონოკლონური ანტიNF ანტისხეულები (Miltenyi Biotec - კლონი: cA2) ეტიკეტირებული ფტოროქრომით.
გარდა ამისა, უჯრედები შეღებილი იყო ანტი-P4/80 და ანტი-CD 1 lb ანტისხეულებით, კონიუგირებული ფტოროქრომებთან. ნიმუშები გაანალიზდა F ACS Aria ინსტრუმენტზე (BDBiosciences) ან Guava EasyCyte 8HT (Milipore) და შემდეგ დამუშავდა FlowJo პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით (Treestar Inc.).
A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულის უნარის შეფასება, შეინარჩუნოს ადამიანის TNF მაკროფაგების ზედაპირზე.
პერიტონეალური მაკროფაგები თაგვებიდან, რომლებიც აწარმოებდნენ ადამიანის TNF-ს, იზოლირებულ იქნა და დათესეს 100,000 უჯრედზე თითო ჭაბურღილში 96 ჭაბურღილის კულტურის ფირფიტებში. უჯრედები ინკუბირებული იყო 2 საათის განმავლობაში 37C ტემპერატურაზე, 5% CO2, რის შემდეგაც არამიმაგრებული უჯრედები ჩამოიბანეთ თბილი ფოსფატის ბუფერით. შემდეგ უჯრედები ინკუბირებული იყო ღამით 37°C-ზე, 5% CO2. 200 მკლ თბილი DMEM გარემოთი დაბანის შემდეგ, უჯრედები ინკუბირებული იყო A9 ანტისხეულებით 2 მკგ/მლ კონცენტრაციით ან DMEM გარემოთი 30 წუთის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. მორიგი გარეცხვის შემდეგ, უჯრედები სტიმულირებული იყო LPS-ით (Sigma, L2630) კონცენტრაციით 100 ნგ/მლ. 4 საათის შემდეგ, შეგროვდა კულტურის სუპერნატანტები და ადამიანის TNF კონცენტრაცია გაზომილი იყო ELISA ნაკრების გამოყენებით (eBioscience, 88-7346) მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით.
ძვლის ტვინი თაგვებიდან, რომლებიც აწარმოებდნენ ადამიანის TNF-ს, იზოლირებული იყო, რის შემდეგაც უჯრედები 10 დღის განმავლობაში კულტივირებული იყო კონდიციონირებულ გარემოში (მიღებული ხაზი L929), შემდეგ უჯრედები ამოიღეს პლასტმასიდან ყინულივით ცივი ფოსფატის ბუფერით. ცოცხალი უჯრედების რაოდენობა დაითვალა და ისინი დაჯდა 96 ჭაბურღილის ფირფიტაზე 50000 უჯრედი/ჭარის კონცენტრაციით. შემდეგ უჯრედებს დაემატა 250 მმ A9 ანტისხეული ან hTNF-VffH ერთი დომენის ანტისხეული ან ცარიელი გარემო (DMEM). უჯრედები ინკუბირებული იყო ანტისხეულებით 30 წუთის განმავლობაში. ჭაბურღილები შემდეგ გარეცხეს ფოსფატის ბუფერული მარილით. ამის შემდეგ, TNF წარმოების სტიმულირება მოხდა LPS (Sigma - L2630) კონცენტრაციით 100 ნგ/მლ. 4 საათის შემდეგ, სუპერნატანტები შეგროვდა, მათში TNF-ის კონცენტრაცია გაზომილი იყო ციტოტოქსიური ტესტის გამოყენებით თაგვის ფიბროსარკომის L929 ხაზზე, ზემოთ აღწერილი პროტოკოლის მიხედვით.
ფლუორესცენტური სენსორის Vhh41-KTNFin ვიტრო და in vivo ბიოლოგიური თვისებების შესწავლა
თაგვის ხაზებზე მიღებულ ექსპერიმენტულ მონაცემებზე დაყრდნობით, რომლებშიც Tnf გენი წაშლილია ცალკეულ უჯრედულ პოპულაციებში, ჩამოყალიბდა ჰიპოთეზა სხვადასხვა ტიპის იმუნოციტების მიერ წარმოებული TNF-ის შესაძლო სხვადასხვა ფუნქციების შესახებ. ამგვარად, ახლახან აჩვენეს, რომ ექსპერიმენტული ტუბერკულოზის ინფექციის მოდელში TNF-ს, რომელსაც წარმოქმნის T-ლიმფოციტები, მაგრამ არა მიელოიდური უჯრედები, აქვს უნიკალური დამცავი ფუნქცია. გარდა ამისა, ჩვენს ლაბორატორიაში მიღებულია მონაცემები, რომლებიც მიუთითებს მიელოიდური უჯრედებიდან TNF-ის პათოგენურ თვისებებზე აუტოიმუნურ დაავადებებში. PMB-ის თერაპიულად გამოყენებული სრული ბლოკირება არ ითვალისწინებს ამ მახასიათებლებს. როგორც ამ ჰიპოთეზის შემუშავების ნაწილი, არჩეული იქნა TNF-ის სპეციფიკური ინჰიბირება, რომელიც წარმოიქმნება მონოციტები-მაკროფაგების სერიის უჯრედების მიერ, რომელსაც შეიძლება ჰქონდეს მნიშვნელოვანი უპირატესობა ამ ციტოკინის სისტემურ ბლოკირებასთან შედარებით. კერძოდ, B- და T- ლიმფოციტების მიერ წარმოებული TNF-დან დაუზიანებელმა სიგნალმა შეიძლება შეამციროს გვერდითი ეფექტების სიხშირე და, გარდა ამისა, გახადოს ანტიNF თერაპია ეფექტური იმ დაავადებებში, რომელთათვისაც TNF ბლოკატორებს ადრე არ გამოუჩენიათ კლინიკური ეფექტურობა ან თუნდაც გამოწვეული. სიმპტომების ზრდა. გარდა ამისა, ამ მიდგომამ შეიძლება პოტენციურად შეამციროს საჭირო დოზა მწარმოებელ უჯრედებში მიზნობრივი მიწოდების გზით.
ამ ვარაუდის შესამოწმებლად, ჩვენ შევქმენით და გამოვცადეთ ორსპეციფიკური ანტისხეული, რომელიც აკავშირებს მაკროფაგის ზედაპირის ერთ ნაწილს F4/80 ტრანსმემბრანულ მოლეკულასთან ურთიერთქმედების გამო, ხოლო სხვა სპეციფიკით იჭერს და ბლოკავს მათ მიერ წარმოქმნილ TNF-ს.
ბისპეციფიკური ანტისხეულების მოლეკულური კლონირება, ექსპრესია და გაწმენდა. ბისპეციფიკურ ანტისხეულს, მაკროფაგის TNF-ის შერჩევითი ბლოკატორი, ეწოდა A9. ერთი დომენის მაბლოკირებელი ანტიNF ანტისხეული hTNF-VffH და ერთი ჯაჭვის ანტისხეული (scFv) მაკროფაგის ზედაპირის მარკერის F4/80 წინააღმდეგ (მოწოდებულია ს. გორდონის (ოქსფორდის უნივერსიტეტი, დიდი ბრიტანეთი) და მ. სტასიის (ლიდსის უნივერსიტეტი, დიდი ბრიტანეთი) მიერ. გამოყენებული იქნა გენეტიკური კონსტრუქციის შესაქმნელად, რომელიც აკოდირებს მას.მიმდევრობები, რომლებიც აკოდირებს ორივე ანტისხეულს, გაძლიერდა პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციით (PCR) და კლონირებულ იქნა ექსპრესიის ვექტორში ისე, რომ ისინი იმავე კითხვის ჩარჩოში იყვნენ და ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა, რომელიც აკოდირებდა მოქნილ გლიცინ-სერინს. მათ შორის ჩამოყალიბდა დამაკავშირებელი (GSGGGGSG) თანმიმდევრობა, რომელიც აკოდირებს ჰისტიდინის ჰექსამერი განლაგებულია მიმდევრობის C-ბოლოზე ცილის შემდგომი გამწმენდისთვის (სურ. 31).
ბისპეციფიკური A9 ანტისხეულის დიზაინი, მისი მოქმედების მექანიზმის სქემატური წარმოდგენა, ბისპეციფიკური A9 ანტისხეულის კოდირებული გენეტიკური კონსტრუქციების სტრუქტურა და TNF-ის საკონტროლო სისტემური ბლოკატორი, tA9 ანტისხეული. (A) A9 ბისპეციფიკური ანტისხეული შედგება ერთი დომენის ანტისხეულისგან (VHH) ადამიანის TNF-ის წინააღმდეგ და ერთი ჯაჭვის ანტისხეულისგან (scFv) F4/80 ზედაპირის მოლეკულის წინააღმდეგ, რომელიც გამოხატულია მონოციტებსა და მაკროფაგებზე. (B) მაკროფაგების მიერ წარმოებული TNF-ის შერჩევითი ბლოკირების პრინციპი: A9 აკავშირებს მაკროფაგების ზედაპირს და იჭერს მათი ზედაპირიდან გამოთავისუფლებულ TNF-ს, რაც ხელს უშლის მის სისტემურ მიმოქცევაში შესვლას. (B) A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულისა და საკონტროლო TNF სისტემური ბლოკატორის, tA9 გენეტიკური კონსტრუქციის დიაგრამა. ერთდომენიანი ანტი-NF ანტისხეულების გენს მოჰყვება თანმიმდევრობა, რომელიც აკოდირებს მოქნილი გლიცინ-სერინის ლინკერს და შემდეგ ერთჯაჭვიან ანტი-F4/80 ანტისხეულის გენს. ამას მოჰყვება თანმიმდევრობა, რომელიც აკოდირებს ჰისტიდინის ჰექსამერს აფინურობის გამწმენდისთვის. საკონტროლო tA9 ანტისხეულს აქვს მსგავსი თანმიმდევრობა, გარდა იმისა, რომ ანტი-P4/80 ანტისხეულის 6 ჰიპერცვლადი რეგიონი ჩანაცვლებულია (Gly3Ser)n ტიპის თანმიმდევრობებით, რაც ხელს უშლის ანტისხეულს მაკროფაგების ზედაპირზე შეერთებას და აქცევს მას. სისტემური TNF ინჰიბიტორი.
მაკროფაგების მიერ წარმოებული TNF-ის სპეციფიკური ბლოკირების ეფექტის შესასწავლად საჭირო იყო საკონტროლო სისტემური ბლოკატორი. ანტისხეულების აფინურობის განსხვავებასთან დაკავშირებული ეფექტების თავიდან აცილების მიზნით, გადაწყდა ბლოკატორის გამოყენება, რომელსაც აქვს მსგავსი A9 TNF-ის დამაკავშირებელი ადგილი. და იმისათვის, რომ გამოირიცხოს სხვა ფაქტორების გავლენა, კერძოდ, იზოელექტრული წერტილი და მოლეკულური წონა, რომლებმაც შეიძლება გავლენა მოახდინონ ნახევარგამოყოფის პერიოდზე, საკონტროლო ანტისხეული მაქსიმალურად ახლოს უნდა იყოს პირველადი ამინომჟავების თანმიმდევრობით შესასწავლელთან. ამიტომ, ჩვენ ავაშენეთ საკონტროლო ანტისხეული - tA9, რომელსაც აქვს იგივე სტრუქტურა და ამინომჟავების თანმიმდევრობა, როგორც A9, გარდა იმისა, რომ მისი ჰიპერცვლადი რეგიონებიდან 6 ანტი-P4/80 scFv ჩანაცვლებულია (Gly3Ser)n ტიპის მიმდევრობით. სიგრძე, როგორც ორიგინალური CDR რეგიონები (იხ. სურ. 31B).
ორივე ანტისხეული გამოხატული იყო ბაქტერიულ სისტემაში და გაწმენდილი იყო აფინური ქრომატოგრაფიით.
A9 ანტისხეულის ზომა, რომელიც განისაზღვრება ელექტროფორეზული მობილურობით და HPLC მონაცემებით, შეესაბამებოდა გამოთვლილ მოლეკულურ წონას 45 კდა (სურ. 32). ქრომატოგრაფია. მარცხნივ - ცილების მოლეკულური წონის მნიშვნელობები. (B) A9 ორსპეციფიკური ანტისხეულის ქრომატოგრამა (მონიშნული წითლად) მოლეკულური წონის მარკერების ქრომატოგრამაზე. (ბ) მოლეკულის ტრანზიტის დროის ფუნქცია მოლეკულური წონის მიხედვით. A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულის გამოთვლილი მოლეკულური წონა იყო 43.4 კდა.
A9 და tA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედება ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-თან. A9 და mA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედების კინეტიკა ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-თან გაზომილი იყო ზედაპირული პლაზმონის რეზონანსით. ამისათვის ორივე ანტისხეული 50 ნმ კონცენტრაციით იყო იმობილიზებული სენსორის ჩიპის ზედაპირზე, რის შემდეგაც ადამიანის რეკომბინანტული TNF სერიულ განზავებაში 50-3 ნმ იყო გამოყენებული, როგორც ანალიტი, და ურთიერთქმედების კინეტიკა გაზომეს ProteOn-ზე. XPR36 ინსტრუმენტი. ორივე ანტისხეულმა აჩვენა მაღალი აფინურობა: A9 და tA9 Kd იყო 85 და 95 pM, შესაბამისად. ეს ადასტურებს, რომ შემოღებულმა მუტაციებმა არ იმოქმედა TNF-ის შეკავშირებაზე. გარდა ამისა, ორივე ანტისხეულს ჰქონდა შეკავშირების სიჩქარის (Kforward, on-rate) და დისოციაციის სიჩქარის (Kreverse, off-rate) მსგავსი პარამეტრები - ნაჩვენებია ნახ. 33 და ტაბ. 3. ნელი დისოციაციის სიჩქარემ უნდა მისცეს A9 ანტისხეულს შეინარჩუნოს შეკრული TNF.
ახალი რეკომბინანტული ერთდომენიანი ანტისხეულის წარმოება და დახასიათება, რომელიც სპეციალურად უკავშირდება ადამიანის TNF-ს, მაგრამ არ ბლოკავს მის ბიოლოგიურ აქტივობას
A9 და mA9 ანტისხეულების ურთიერთქმედების კინეტიკა ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-თან გაზომილი იყო ზედაპირული პლაზმონის რეზონანსით. ამისათვის ორივე ანტისხეული 50 ნმ კონცენტრაციით იყო იმობილიზებული სენსორის ჩიპის ზედაპირზე, რის შემდეგაც ადამიანის რეკომბინანტული TNF სერიულ განზავებაში 50-3 ნმ იყო გამოყენებული, როგორც ანალიტი, და ურთიერთქმედების კინეტიკა გაზომეს ProteOn-ზე. XPR36 ინსტრუმენტი. ორივე ანტისხეულმა აჩვენა მაღალი აფინურობა: A9 და tA9 Kd იყო 85 და 95 pM, შესაბამისად. ეს ადასტურებს, რომ შემოღებულმა მუტაციებმა არ იმოქმედა TNF-ის შეკავშირებაზე. გარდა ამისა, ორივე ანტისხეულს ჰქონდა შეკავშირების სიჩქარის (Kforward, on-rate) და დისოციაციის სიჩქარის (Kreverse, off-rate) მსგავსი პარამეტრები - ნაჩვენებია ნახ. 33 და ტაბ. 3. ნელი დისოციაციის სიჩქარემ უნდა მისცეს A9 ანტისხეულს შეინარჩუნოს შეკრული TNF.
ბისპეციფიკური ანტისხეულის A9 და საკონტროლო ანტისხეულის tA9 ურთიერთქმედების კინეტიკა ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-თან. (A) ნაჩვენებია ადამიანის რეკომბინანტული TNF-ის ურთიერთქმედების მრუდები (სენსოგრამები) 50 ნმ - 3 ნმ კონცენტრაციებზე სენსორის ჩიპთან, რომელზეც იყო იმობილიზებული A9 ბისპეციფიკური ანტისხეული და საკონტროლო tA9 ანტისხეული. აბსციზა აჩვენებს დროს წამებში, ორდინატი აჩვენებს რეზონანსული კუთხის ცვლას ჩვეულებრივ ერთეულებში (AU). (B) სენსოგრამების თითოეული ჯგუფისთვის გამოითვალა შებოჭვის სიჩქარე (ოპ-სიჩქარე), დისოციაციის სიჩქარე (გამორთვის სიჩქარე) და დისოციაციის მუდმივი (Kd). შედეგად მიღებული საშუალო მნიშვნელობები და ასევე სტანდარტული გადახრა (SD) გამოსახულია იზოაფინურობის დიაგრამაზე. დიაგონალური ხაზები შეესაბამება დისოციაციის მუდმივის მითითებულ მნიშვნელობებს.
A9 ანტისხეულის შედარებითი აქტივობის შესაფასებლად TNF-ის ბიოლოგიური ეფექტების დათრგუნვაში, შესრულდა ციტოტოქსიური ტექსტი L929 თაგვის ფიბროსარკომის ხაზზე. A9 და mA9 ანტისხეულების სერიული განზავება დაემატა ადამიანის რეკომბინანტულ TNF-ს და აქტინომიცინ-D-ს მუდმივ კონცენტრაციებს. მიღებული მონაცემების მიხედვით, ანტისხეულებს A9 და rA9 აქვთ მსგავსი ანტიNF აქტივობა (სურ. 34 A). გარდა ამისა, დადასტურდა, რომ ბისპეციფიკური ანტისხეულის A9 აქტივობა შეესაბამება ერთდომენიანი ანტი-NF ანტისხეულის hTNF-VffH აქტივობას, რომელიც არის A9 და mA9 ნაწილი (ნახ. 34 B). 10 10 10
A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულის, mA9 საკონტროლო ანტისხეულისა და hTNF-VffH ერთი დომენის ანტისხეულის ანტიNF აქტივობა. (A) A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულისა და საკონტროლო tA9 ანტისხეულის აქტივობის შედარება. ნაჩვენებია L929 თაგვის ფიბროსარკომის უჯრედების გადარჩენის მრუდი ადამიანის TNF-ის მუდმივი დოზისა და A9 და tA9 ანტისხეულების კლებადი დოზების ერთდროული ზემოქმედების ქვეშ. (B) A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულისა და hTNF-VnH ერთი დომენის ანტისხეულის აქტივობის შედარება. L929 თაგვის ფიბროსარკომის უჯრედების გადარჩენის მრუდი ნაჩვენებია ადამიანის TNF-ის მუდმივი დოზისა და A9 და hTNF-VHH ანტისხეულების კლებადი დოზების ერთდროული ზემოქმედებით. შედარება ჩატარდა მოლარულ კონცენტრაციებში, რათა გამოირიცხოს განსხვავება მოლარულ მასაში. ანტისხეულების განსაზღვრულ აქტივობაზე.
ანტისხეულების A9 და mA9 შეკავშირების ანალიზი მაკროფაგების ზედაპირზე ზედაპირულ მოლეკულასთან F4/80 ურთიერთქმედების გზით.
A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულის უნარი მაკროფაგების ზედაპირთან სპეციფიურად შეკავშირების მიზნით შეფასდა ნაკადის ციტომეტრიით. ამისათვის პერიტონეუმის ღრუდან გამოყოფილი უჯრედები ინკუბირებული იყო A9 ანტისხეულებით, რის შემდეგაც ისინი შეღებილ იქნა მაკროფაგური მარკერებისთვის CD1 lb და F4/80, და ამავე დროს ჩატარდა სპეციფიური შეღებვა ორსპეციფიკური A9 ანტისხეულისთვის VHH-ის ანტისხეულების საშუალებით. ან ანტისხეულები პოლიჰისტიდინის ეტიკეტზე. შემდეგ ნიმუშები ჩაუტარდა ნაკადის ციტომეტრიას და ანალიზს.
ამ ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ A9 ორსპეციფიკურ ანტისხეულს შეუძლია მიბმა პერიტონეუმის უჯრედების ზედაპირზე, რომლებიც გამოხატავენ F4/80 და CD1 lb მათ ზედაპირზე (მონოციტები და მაკროფაგები) (ნახ. 35 A - D). ამავდროულად, A9 არ უკავშირდება პერიტონეუმის ღრუს უჯრედებს, რომლებსაც არ გააჩნიათ ეს მარკერები (ძირითადად ლიმფოციტები) (სურ. 35 E და F). პარალელური ანტი-F4/80 შეღებვის დონის დაქვეითება A9 ანტისხეულის დამატებით, ორი ანტისხეულის კონკურენციის გამო მიზანთან შეკავშირების გამო, ადასტურებს, რომ A9 კონკრეტულად ურთიერთქმედებს ამ კონკრეტულ მოლეკულასთან უჯრედის ზედაპირზე (ნახ. 35 G და 3).
ასევე გამოიყენება სახელი Mac-1. კომპლემენტის სისტემის C3 რეცეპტორის კომპონენტის შემადგენელი ელემენტი. თაგვებში ის გამოხატულია მონოციტებზე, მაკროფაგებზე და მიკროგლიურ უჯრედებზე. ორსპეციფიკური ანტისხეული
პერიტონეუმის ღრუს უჯრედები ინკუბირებული იყო A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულით ან მის გარეშე (წითლად ნაჩვენები) ან მის გარეშე (აჩვენა ლურჯად) და შემდეგ შეღებეს ფლუორესცენტურად მონიშნული ანტისხეულებით მონოციტ-მაკროფაგური უჯრედებისთვის სპეციფიკური ზედაპირული მარკერების მიმართ, ასევე სპეციფიკური ანტისხეულებისთვის. A9-მდე. შემდეგ მიღებული ნიმუშები გაანალიზდა ნაკადის ციტომეტრიით. (A, C, E, G) შეღებვა VHH დომენის ანტისხეულების მეშვეობით. (B, D, F, 3) შეღებვა ანტისხეულების მეშვეობით პოლიჰექსიდინის თანმიმდევრობის მიმართ. (A, B) A9 ბისპეციფიკური ანტისხეული აკავშირებს უჯრედებს შერჩეულ მაღალი F4/80 და CD1 lb ექსპრესიისთვის (მაკროფაგები). გამოსახულ ჰისტოგრამაზე ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში A9-ზე, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს მოვლენის დადგომის ნორმალიზებულ სიხშირეს. (C, D) იგივე გაფანტული ჰისტოგრამის სახით. ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში A9-ზე, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში F4/80-ზე. (E, E) ორსპეციფიკური ანტისხეული A9 არ უკავშირდება პერიტონეუმის ღრუს უჯრედებს, რომლებიც არ გამოხატავენ F4/80 და CD1 lb (ლიმფოციტები). გამოსახულ ჰისტოგრამაზე ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში A9-ზე, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს მოვლენის დადგომის ნორმალიზებულ სიხშირეს. (G, 3) -ინკუბაცია A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულით ამცირებს შეღებვის ინტენსივობას F4/80-ით. გამოსახულ ჰისტოგრამაზე ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში F4/80-ზე, ვერტიკალური ღერძი გვიჩვენებს მოვლენის წარმოქმნის ნორმალიზებულ სიხშირეს.
ძვლის ტვინის მაკროფაგები ინკუბირებული იყო A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულით (გამოსახულია წითლად), მის გარეშე (გამოსახულია ლურჯად), ან საკონტროლო tA9 ანტისხეულით (ნაჩვენებია შავი) და შემდეგ შეღებილი იქნა A9/mA9-სთვის სპეციფიკური ანტისხეულებით. მიღებული ნიმუშები გაანალიზდა ნაკადის ციტომეტრიით. (A) A9 ბისპეციფიკური ანტისხეული სპეციალურად უკავშირდება ძვლის ტვინის მაკროფაგებს. გამოსახულ ჰისტოგრამაზე ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში A9-ზე, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს მოვლენის დადგომის ნორმალიზებულ სიხშირეს. (B) mA9 საკონტროლო ანტისხეული ვერ აკავშირებს ძვლის ტვინის მაკროფაგებს. გამოსახულ ჰისტოგრამაზე ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას შეღებვის არხში wA9-ზე, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს მოვლენის დადგომის ნორმალიზებულ სიხშირეს.
გარდა ამისა, დამატებით ციტოფლუორომეტრულ ექსპერიმენტებში აჩვენეს, რომ A9 ანტისხეულს, მაკროფაგების ზედაპირზე მიმაგრებისას, შეუძლია ერთდროულად შეაერთოს ეგზოგენურად დამატებული ადამიანის TNF (ნახ. 37). ეს ადასტურებს, რომ ბისპეციფიკური ანტისხეულის ორივე ქვედანაყოფი ერთდროულად ფუნქციურად აქტიურია და რომ ორი ანტიგენის ერთდროულად შეკავშირება სტერილურად შესაძლებელია.
პერიტონეუმის ღრუს უჯრედები ინკუბირებული იყო A9 ბისპეციფიკური ანტისხეულით ან მის გარეშე (გამოსახულია წითლად) ან მის გარეშე (გამოსახულია ლურჯად), შემდეგ ადამიანის რეკომბინანტული TNF-ით, რის შემდეგაც ისინი შეღებილ იქნა ფლუორესცენტურად მარკირებული ანტისხეულებით მონოციტ-მაკროფაგისთვის სპეციფიკური ზედაპირული მარკერების მიმართ. უჯრედები, ასევე ანტისხეულები, რომლებიც სპეციფიკურია ადამიანის TNF-სთვის. მიღებული ნიმუშები გაანალიზდა ნაკადის ციტომეტრიით. (A) A9 ორსპეციფიკური ანტისხეული, რომელსაც შეუძლია შეინარჩუნოს ადამიანის TNF მაკროფაგების ზედაპირზე (უჯრედები შერჩეული F4/80 და CD1 lb-ის მაღალი ექსპრესიისთვის). გამოსახულ ჰისტოგრამაზე ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობას TNF შეღებვის არხში, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს მოვლენის მოვლენის ნორმალიზებულ სიხშირეს. (B) იგივე მონაცემები სკატერული ჰისტოგრამის სახით. ჰორიზონტალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობებს TNF შეღებვის არხში, ვერტიკალური ღერძი აჩვენებს ფლუორესცენციის მნიშვნელობებს F4/80 შეღებვის არხში.
პროტეინის ინჟინერია, მოლეკულური ბიოლოგიისა და ბიოინჟინერიის დარგი, რომლის ამოცანები მოიცავს ბუნებრივი ცილების სტრუქტურის მიზანმიმართულ ცვლილებას და სასურველი თვისებების მქონე ახალი ცილების წარმოებას. პროტეინის ინჟინერია წარმოიშვა 1980-იანი წლების დასაწყისში, როდესაც შემუშავდა გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდები, რამაც შესაძლებელი გახადა სხვადასხვა ბუნებრივი ცილების მიღება ბაქტერიების ან საფუარის გამოყენებით, ასევე გენების სტრუქტურის გარკვეული გზით შეცვლა და, შესაბამისად, ამინომჟავების თანმიმდევრობა ( პირველადი სტრუქტურა) მათ მიერ კოდირებული ცილების. ცილის მოლეკულების ორგანიზების პრინციპებზე დაყრდნობით, ცილების სტრუქტურასა და ფუნქციას შორის ურთიერთობას, ცილის ინჟინერია ქმნის მეცნიერულად დაფუძნებულ ტექნოლოგიას მათ სტრუქტურაში მიმართული ცვლილებებისთვის. ცილების ინჟინერიის დახმარებით შესაძლებელია ცილების თერმული მდგრადობის გაზრდა, მათი წინააღმდეგობის გაწევა დენატურული ეფექტების, ორგანული გამხსნელების მიმართ და მათი ლიგანდების დამაკავშირებელი თვისებების შეცვლა. პროტეინის ინჟინერია საშუალებას იძლევა, ამინომჟავების შეცვლით, გააუმჯობესოს ფერმენტების ფუნქციონირება და მათი სპეციფიკა, შეცვალოს ოპტიმალური pH მნიშვნელობები, რომლებზეც მუშაობს ფერმენტი, აღმოფხვრას არასასურველი გვერდითი აქტივობები, აღმოფხვრას მოლეკულური რეგიონები, რომლებიც აფერხებენ ფერმენტულ რეაქციებს, გაზრდის ცილის ეფექტურობას. ნარკოტიკები და ა.შ. მაგალითად, მხოლოდ ერთი თრეონინის ნარჩენის ჩანაცვლებამ ალანინით ან პროლინის ნარჩენით შესაძლებელი გახადა 50-ჯერ გაიზარდა ტიროსილ-tRNA სინთეზის ფერმენტის აქტივობა და 8 ამინომჟავის ნარჩენების ჩანაცვლების გამო ე.წ. თერმოლიზინ-. ისევე როგორც პროტეაზა Bacillus stearothermophilus-მა შეიძინა უნარი შეინარჩუნოს აქტივობა 120 °C ტემპერატურაზე რამდენიმე საათის განმავლობაში. პროტეინის ინჟინერია ასევე მოიცავს სამუშაოებს ცილების თვისებების მიმართულ ცვლილებებზე ქიმიური მოდიფიკაციების გამოყენებით, მაგალითად, ფოტოგააქტიურებული ნაერთების დანერგვა, რომლებიც ცვლის მოლეკულის თვისებებს სინათლის ზემოქმედებით, ნაერთების ეტიკეტზე, რაც შესაძლებელს ხდის თვალის მიდევნებას ცილა უჯრედში ან მიმართოს მას უჯრედის სხვადასხვა კომპონენტზე და მსგავსი. ასეთი სამუშაო ძირითადად ტარდება გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდებით მიღებულ რეკომბინანტულ ცილებზე.
ცილების ინჟინერიაში შეიძლება გამოიყოს ორი მიმართულება: რაციონალური დიზაინი და ცილების მიმართული მოლეკულური ევოლუცია. პირველი გულისხმობს ცილების სტრუქტურულ-ფუნქციური ურთიერთობების შესახებ ინფორმაციის გამოყენებას, რომელიც მიიღება ფიზიკურ-ქიმიური და ბიოლოგიური მეთოდებით, ასევე კომპიუტერული მოლეკულური მოდელირებით, რათა განისაზღვროს პირველადი სტრუქტურის რომელმა ცვლილებამ უნდა მიგვიყვანოს სასურველ შედეგამდე. ასე რომ, ცილის თერმული სტაბილურობის გასაზრდელად აუცილებელია მისი სივრცითი სტრუქტურის დადგენა, "სუსტი" უბნების იდენტიფიცირება (მაგალითად, ამინომჟავები, რომლებიც მჭიდროდ არ არის დაკავშირებული მათ გარემოსთან), შეარჩიეთ საუკეთესო ვარიანტები სხვა ამინოსთვის ჩანაცვლებისთვის. მჟავები მოლეკულური მოდელირების გამოყენებით და მოლეკულის ენერგეტიკული პარამეტრების ოპტიმიზაცია; ამის შემდეგ მოახდინეთ შესაბამისი გენის მუტაცია და შემდეგ მიიღეთ და გაანალიზეთ მუტანტური ცილა. თუ ეს ცილა არ აკმაყოფილებს მითითებულ პარამეტრებს, ჩაატარეთ ახალი ანალიზი და გაიმეორეთ აღწერილი ციკლი. ეს მიდგომა ყველაზე ხშირად გამოიყენება სასურველი თვისებების მქონე ხელოვნური ცილების (de novo პროტეინების) აგების შემთხვევაში, როდესაც შეყვანა არის ახალი ამინომჟავების თანმიმდევრობა, ძირითადად ან მთლიანად განსაზღვრული ადამიანის მიერ, და გამომავალი არის ცილის მოლეკულა სასურველი. მახასიათებლები. თუმცა, ჯერჯერობით, ამ გზით შესაძლებელია მხოლოდ მცირე de novo ცილების მიღება მარტივი სივრცითი სტრუქტურით და მათში მარტივი ფუნქციური აქტივობების შეტანა შესაძლებელია, მაგალითად, ლითონის შემაკავშირებელი ადგილები ან მოკლე პეპტიდური ფრაგმენტები, რომლებიც ატარებენ რაიმე ბიოლოგიურ ფუნქციას.
ცილების მიმართული მოლეკულური ევოლუციის დროს გენეტიკური ინჟინერიის მეთოდებით მიიღება სამიზნე ცილის სხვადასხვა მუტანტური გენების დიდი ნაკრები, რომლებიც შემდეგ გამოხატულია სპეციალური გზით, კერძოდ, ფაგების ზედაპირზე („ფაგის ჩვენება“) ან ბაქტერიული უჯრედები, რათა შესაძლებელი გახდეს საუკეთესო თვისებების მქონე მუტანტების შერჩევა. ამ მიზნით, მაგალითად, სასურველი ცილის ან მისი ნაწილების გენები ინტეგრირებულია ფაგის გენომში - ფაგის ნაწილაკების ზედაპირზე მდებარე ცილის მაკოდირებელი გენის შემადგენლობაში. ამავდროულად, თითოეული ცალკეული ფაგი ატარებს საკუთარ მუტანტ ცილას, რომელსაც აქვს გარკვეული თვისებები, რის მიხედვითაც ხდება შერჩევა. მუტანტური გენები წარმოიქმნება სხვადასხვა ორგანიზმების მსგავსი ბუნებრივი ცილების გენების ნაკრების „შერევით“, ჩვეულებრივ, პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის მეთოდის გამოყენებით, ისე, რომ ყოველი მიღებული მუტანტური ცილა შეიძლება შეიცავდეს მრავალი „მშობელი“ ცილის ფრაგმენტებს. არსებითად, ეს მიდგომა მიბაძავს ცილების ბუნებრივ ევოლუციას, მაგრამ მხოლოდ ბევრად უფრო სწრაფი ტემპით. ცილის ინჟინრის მთავარი ამოცანა ამ შემთხვევაში არის ეფექტური შერჩევის სისტემის შემუშავება, რომელიც საშუალებას მისცემს შეარჩიოს საუკეთესო მუტანტური ცილის ვარიანტები სასურველი პარამეტრებით. ზემოაღნიშნული ამოცანის შემთხვევაში - ცილის თერმული სტაბილურობის გასაზრდელად - შერჩევა შეიძლება განხორციელდეს, მაგალითად, მუტანტის გენების შემცველი უჯრედების გაზრდით ამაღლებულ ტემპერატურაზე (იმ პირობით, რომ უჯრედში მუტანტის ცილის არსებობა გაზრდის მის თერმული სტაბილურობა).
ცილის ინჟინერიის ორივე ამ სფეროს აქვს იგივე მიზანი და ავსებს ერთმანეთს. ამრიგად, მოლეკულური ევოლუციის მეთოდების გამოყენებით მიღებული მუტანტური ცილების ვარიანტების შესწავლა შესაძლებელს ხდის ცილის მოლეკულების სტრუქტურული და ფუნქციური ორგანიზაციის უკეთ გაგებას და მიღებული ცოდნის გამოყენებას ახალი ცილების მიზანმიმართული რაციონალური დიზაინისთვის. ცილის ინჟინერიის შემდგომი განვითარება შესაძლებელს ხდის მრავალი პრაქტიკული პრობლემის გადაჭრას ბუნებრივი ცილების გაუმჯობესებისა და ახალი ცილების მიღების შესახებ მედიცინის, სოფლის მეურნეობის და ბიოტექნოლოგიის საჭიროებებისთვის. სამომავლოდ შესაძლებელია ბუნებაში უცნობი ფუნქციების მქონე ცილების შექმნა.
ლიტ.: Brannigan J.A., Wilkinson A.J. პროტეინის ინჟინერია 20 წელი // Nature Reviews. მოლეკულური უჯრედის ბიოლოგია. 2002 წ. 3. No12; Patrushev L. I. ხელოვნური გენეტიკური სისტემები. მ., 2004. ტ. 1: გენეტიკური და ცილის ინჟინერია.
